MicroRNA-208b在急性心肌梗死患者的早期诊断价值

李建民 叶 军 王如珠 林 杰 刘 玲 王 斌

(泰州市人民医院心内科，江苏 泰州 225300)

临床上目前最有效的心肌损伤标记物主要是肌酸激酶同工酶(CK-MB) 及心肌肌钙蛋白(cTn)I，而其最主要的缺点是组织释放迟缓及特异性稍差。在探索急性心肌梗死(AMI)新的高效、敏感度及特异度更好的生物标记物中，MicroRNA(MiR)受到关注〔1～3〕。有研究显示MiR208特异表达于心肌细胞，参与心肌细胞的肥大、纤维化过程〔4，5〕。在正常人群中，循环系统几乎检测不到MiR-208b，但在心肌梗死动物模型及心肌梗死患者中显著增加〔4，6〕。在鉴别心肌梗死和其他疾病导致标志物升高方面MiR-208b较cTnI有明显的优势〔7～9〕。本研究主要评估MiR-208b在AMI的早期诊断价值。

1 资料与方法

1.1研究分组 采用前瞻性研究方法，选择2017年1～12月泰州市人民医院就诊AMI患者60例为实验组、选取同期冠脉造影证实冠脉未见异常患者40例为对照组、选择存在心绞痛症状且冠脉造影证实为冠心病不稳定型心绞痛(UA)患者40例作为UA组。

1.2筛选标准 入选标准：①胸痛症状小于3 h。②均经急诊冠脉造影证实为AMI。排除标准：①患者主诉发病时间>3 h ；或者主诉发病时间虽然<3 h，但结合心电图动态演变，提示非急性期改变，cTnI 或CK-MB无动态升高或首次检测已接近峰值。②终末期肾病(ESRD)及肿瘤患者。

1.3研究内容 所有入选患者完善一般基础资料，次日清晨空腹采血，空腹时乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集全血，离心分离血浆，送检验科全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血肌酐。AMI组发病3 h，UA组及对照组于冠脉造影术后第2天清晨取静脉血5 ml，EDTA二钾(EDTA-K2)抗凝，离心取血浆，送检验科测定cTnI、CK-MB水平(电化学发光法)。

1.4MiR-208b的实时荧光定量PCR检测 用EDTA 抗凝采集各组血浆标本，以U6snRNA为内参。U6snRNA正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-′3；MiR-208b正向引物：5′-GCGCGATAAGACGAACAAAA-3′，反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。引物合成公司：南京金斯瑞科技有限公司。

1.4.1RNA提取 全血离心，取200 μl血清，加入1 ml预冷的Trizol，加入氯仿120 μl；12 000 r/min，4℃离心15 min；取无色上清水相移至另一离心管，水相体积约为所用Trizol试剂的60%；向得到的上清水相加入等体积的异丙醇，静置10 min；12 000 r/min，4℃离心10 min；去除上清，加入1 ml 70%的乙醇；12 000 r/min，4℃离心10 min；吸尽上清，加入15.0 μl的DEPC H2O溶解RNA沉淀，待完全溶解后于-80℃保存。

1.4.2RNA浓度和纯度测定 按照cDNA第一链合成试剂盒(美国 Thermo Fisher K1622)配制逆转录体系(两步法)，到总体积为20 μl，混匀后在普通PCR仪上进行42℃1 h、70℃10 min、4℃ 5 min的反应。上述产物可立即进行下一步的PCR反应或-20℃保存。PCR产物经琼脂糖电泳鉴定扩增的片段大小与目的基因相一致。MiR-208b相对表达量=2-ΔΔct。

1.5统计学方法 采用SPSS16.0 软件进行单因素方差分析、t检验；用受试者工作特征(ROC)曲线分析血浆MiR-208b含量对AMI的诊断效能，计算ROC曲线下面积(AUC)，AUC<0.5为无诊断价值。

2 结 果

2.1各组临床特征比较 与对照组比较，AMI组在性别、吸烟、TC、血肌酐差异无统计学意义(P>0.05)； AMI组年龄、高血压患病数、糖尿病患病数、LDL-C均明显高于对照组(P<0.05)。与UA组比较，AMI组年龄、高血压患病数、糖尿病患病数均较高，差异有统计学意义(P<0.05)，其他指标差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组临床特征比较

与对照组比较：1)P<0.05；与UA组比较：2)P<0.05，下表同

2.2各组cTnI、CK-MB、MiR-208b水平比较 与对照组比较，AMI组、UA组在cTnI、CK-MB、MiR-208b表达上均明显升高(P<0.05)；且AMI组各指标升高较UA组显著(P<0.05)，见表2。

2.3MiR-208b、cTnI、CK-MB的ROC曲线比较 MiR-208b、cTnI、CK-MB的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.952、0.843、0.769，AUC<0.5为无诊断价值。 95%可信区间(95%CI)分别为0.90～0.99、0.73～0.93、0.67～0.86，见图1。

表2 各组cTnI、CK-MB、MiR-208b水平比较

图1 MiR-208b、cTnI、CK-MB的ROC曲线

3 讨 论

AMI在临床中常见，全国胸痛中心建设广泛开展〔10〕，AMI诊治率明显提升，但是目前对AMI标志物的研究仍然没有大的提升，特别是在心肌梗死早期发病4 h以内，没有有效的AMI标志物，对心肌梗死的早期诊断、早期治疗提出了更高的要求。

在探索新的高效、敏感度及特异度更好、更早期的生物标记物的研究中，miRNA取得了显著的优越性。miRNA是一种内源性的小非编码RNA 分子，与信使RNA 通过碱基互补配对结合，调节其基因表达。miRNA在血清或血浆中稳定表达，可抵抗反复冻融和被RNA酶降解。miRNA作为细胞内的RNA，调控转录后表达水平，并认为具有成为治疗学靶点的可能〔2，5〕。

心肌miRNA在心肌中大量表达。它们在心脏发生、心脏功能和病理方面起着核心作用。miR-133a主要控制早期的心脏新生阶段，支持从胚胎干细胞和中胚层前体的心脏特定的肌肉谱系，miR-208和miR-499参与了晚期心原阶段的调节，调节心脏细胞的分化到心肌细胞和快速/慢肌纤维规范。在心脏中，miR-1/133a通过调节心脏动作电位的所有阶段来控制心脏电导和自动性。miR-208/499位于重链的肌凝蛋白基因内，调节肌凝蛋白收缩蛋白的表达。在包括AMI在内的心脏病理学中，心脏miRNA的表达发生了明显的改变，导致了与心脏损伤、心律失常、细胞凋亡、纤维化、肥大和组织重建相关的有害影响。miR-146a、miR-499和miR-196a2的多态性对心血管疾病的发生，发展有明显的影响。每种类型的miRNA在心脏发育或心血管疾病的起源中都有各自的作用〔11〕。多项研究及荟萃分析〔12～14〕显示，血浆miR-33及miR-10a表达与miR155与冠心病的发生、发展有明显的联系。在AMI、心脏miRNA的循环水平明显升高使他们成为一个有前途的诊断AMI的早期诊断标志〔7〕。

cTnI主要结合在肌原纤维上，仅不到5%储存在胞质中；miRNA 蛋白复合物主要存在于胞质。所以在心肌细胞受到损害并坏死时，两者的释放时间曲线不同，miRNA 可更早地在循环血中检测到〔15〕。在大鼠AMI模型中发现MiR-208b有显著升高，而心肌坏死区和边缘区的组织病理却未能检测到。循环血中的miRNA 似乎并不是来自于细胞坏死或细胞凋亡，而是属于某种病生代偿机制〔16〕。研究显示〔8，9，14〕，在欧美人群及亚洲人群中，miRNA-208b在健康人群中几乎没有表达，在心肌梗死人群中显著表达，故认为miRNA-208b在AMI人群中有较高的敏感性及特异性。本研究显示在AMI人群中，其表达明显高于UA组及对照组，ROC曲线显示，其诊断效能要优于cTnI及CK-MB。MiR-208b的释放是否存在其他机制有待于进一步的研究。