重组酶聚合酶扩增技术（RPA）检测拟态弧菌

周广彪 段建发胡晓珊 魏 霜 凌 莉 蔡 颖*

1.汕头海关 广东汕头 515031；2.广州海关

拟态弧菌（Vibrio Mimicus）为革兰氏阴性菌，单鞭毛，具有动力性，与副溶血弧菌、霍乱弧菌等属正常海洋菌丛，广泛存在于河水、海水及海产品中，是很多甲壳类及海水鱼类的易感菌[1-2]。在美国、新西兰、孟加拉及不少非洲国家均有拟态弧菌致病报道，我国福建、上海、北京、江苏及浙江地区也有发病，多呈散发或暴发。拟态弧菌一年四季均可致病，以夏季为多；潜伏期3～72 h，平均24 h；主要症状有腹泻、呕吐、腹痛，以及大便呈水样或粘液血便；发病年龄不限，但小儿少见。因此，对拟态弧菌的检测在公共卫生上具有十分重要的意义[3-4]。

目前，传统方法仍是拟态弧菌检测重要手段，该法首先进行选择性增菌，再结合生化及血清学结果进行鉴定。传统方法的检测结果准确性高，但存在着效率低、耗时长、操作繁琐等显著不足。为满足致病菌快速检测的要求，技术人员发展了酶免疫法（EIA）及酶联荧光免疫检测法（VIDAS-CHL）、胶体金试纸条及API生化鉴定试纸条法、聚合酶链式反应（PCR）及实时荧光PCR法、环介导恒温扩增（LAMP）等快速灵敏的检测方法。其中，以实时荧光PCR为代表的分子检测方法，以其简便快捷、高灵敏度的技术优势，近年来在致病菌检测中的应用越来越广泛[5]。但荧光检测设备普遍售价偏高、产物片段偏小、引物探针设计要求较高等应用难点，在一定程度上限制了该类技术推广，尤其不利于在基层实验室的应用和非实验室环境下现场检测。

重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplifcation，RPA）是继LAMP之后的新型等温核酸扩增技术之一[6]，利用单链DNA结合蛋白（single-stranded DNA binding protein，SSB）将DNA双螺旋解链，在ATP的参与下重组酶与引物结合形成蛋白-核苷酸复合物，该复合物与靶序列匹配结合后再由DNA聚合酶启动合成反应。该方法主要具备以下优点：（1）37℃左右即可反应，不需要梯度温控来实现核酸解链、退火和延伸；（2）仅需1对引物，实验设计简单；（3）反应时间短，只需 30～50 min；（4）结果辨识成本低，使用普通琼脂糖凝胶电泳即可[7]，而且产物还可进行测序确认。

目前国内尚未见到利用RPA技术检测拟态弧菌的报道，本研究拟根据编码拟态弧菌不耐热溶血素（Vibrio mimicus heat-labile hemolysin，VmhA）的基因保守序列，设计RPA检测的引物对，建立拟态弧菌的RPA检测方法，并测试其特异性和灵敏度，建立一种能够快速检测拟态弧菌VmhA的简便、高效、特异、灵敏、适于现场快速检测的技术方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

拟态弧菌（ATCC33653）、创伤弧菌（ATCC27562）、副溶血弧菌（ATCC17802）、河流弧菌（ATCC33809）、溶藻弧菌（ATCC17749）、霍乱弧菌（ATCC39315）、哈维氏弧菌（ATCC33842）、沙门菌（ATCC14028）、大肠埃希菌（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）和单增李斯特菌（ATCC19114）均为本机构购买的标准菌株，其购买来源为中国科学院水生生物研究所、广东食品微生物安全工程技术研究开发中心和美国MBL公司。应用检测的样品均为本机构2016年法定和委托检验中的留样。所用细菌基因组DNA提取试剂盒为天根生化科技有限公司产 （货号DP302），引物由上海生工生物工程有限公司安排合成，电泳级琼脂糖、DNA Marker及显色I剂购自宝生物工程（大连）有限公司，RPA扩增试剂盒为TwistDX公司产TwistAmp Basic kits。

1.2 主要仪器与设备

PCR 扩增仪（Veriti，ABI公司）、核酸蛋白分析仪（ND-1000，Thermo 公司）、电泳仪（DYY-6C，北京六一）、凝胶成像系统（Tanon-1600，天能公司）。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA提取

先将上述标准菌株按照国家标准GB4789《食品卫生微生物学检验标准》进行复壮增菌及生化鉴定，再参照试剂盒说明书，提取基因组DNA，使用核酸蛋白分析仪检测DNA浓度及纯度并统一稀释为100 ng/μL 备用。

1.3.2 引物设计

参考试剂盒中RPA引物设计的要求，根据VmhA基因的保守序列，使用Oligo V6.22软件进行引物的设计和筛选，入选序列再利用Primer Blast工具（NCBI官方网站提供）进行特异性确认，后由上海生工生物工程有限公司安排合成。最终设计检测拟态弧菌的RPA引物，扩增条带467 bp，序列具体如下：上游引物：5′-GAGATATTGGCATCTTTACAAAATGGACGA-3′；下游引物：5′-TGAATCTATTAAGAGGTGCGCA CCCTTCAAGCACT-3′。

1.3.3 RPA检测方法建立

以1.3.1中制备的DNA为模板，采用上述引物进行RPA扩增，同时设置超纯水为阴性对照，测试恒温37℃反应时长分别为30 min、40 min、50 min及60 min时的扩增效果。RPA扩增体系的配制方法具体如下：将再水化缓冲液（Rehydration Buffer）29.5 μL加入到含有冻干酶粉的0.2 mL Twist Amp反应管（Twist AmpBasic kits，Twist）中，再先后加入去离子水 12.5 μL，上、下游引物各 2 μL（终浓度为 0.4 μmol/L），模板 DNA 1μL，最后再加入醋酸镁溶液2.5 μL（280 mmol/L）。待反应结束后，向产物中加入 50 μL酚/氯仿，充分混匀后12 000 rpm离心3 min，取上清液4 μL点样于1.5%琼脂糖凝胶，使用1×TBE缓冲液进行电泳，电泳条件为5 V/cm，恒压电泳40～60 min，最后在凝胶成像系统上观察并记录结果。

1.3.4 RPA检测方法特异性评价

按照1.3.3的RPA检测反应体系及适用扩增时长，对前述11种标准菌株的基因组DNA进行检测，评价建立的RPA检测方法特异性。

1.3.5 RPA检测方法灵敏度评价

将拟态弧菌标准菌株提取的DNA进行10倍梯度稀释，设计5个稀释度，以对应梯度稀释的DNA为模板，按照1.3.3所示的RPA检测反应体系进行灵敏度实验，并参照已报道的拟态弧菌检测引物VMH-F和VMH-R进行PCR灵敏度实验，引物序列 VMH-F：5′-GTCAAAGGGGTATGTGTTAAGGCG TAGTTCTG-3′；VMH-R：5′-CACAGCAGGTTCAAAT CATCGAGCAAACCC-3′，扩增产物长度为 106 bp[5]，比较两种方法检测灵敏度。

1.3.6 RPA检测方法应用效果评价

选取本机构2016年检测留样样品50份，包括20份阳性样品，其中拟态弧菌确认阳性检出2份。样品主要为冻虾仁、冻凤尾对虾、冻牡蛎、活青蟹、金昌鱼以及水质监控样本，参考食品卫生微生物学检验国家标准进行样品处理，使用碱性蛋白胨水增菌培养10 h，取2 mL增菌液离心富集，使用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，货号DP302）提取DNA，使用建立的RPA方法进行拟态弧菌检验，以结果的一致性来评价方法的应用效果。

2 结 果

2.1 RPA检测方法的构建

以拟态弧菌标准菌株基因组DNA为模板，并以超纯水为阴性对照，测试了不同扩增时长的RPA检测效果（图1）。在40 min时便可达到较为理想的扩增效果，VmhA扩增条带与预期目的条带大小一致约467 bp，阴性对照未扩增到可见条带，本实验所建立的RPA检测体系能够准确检测VmhA基因。

图1 RPA技术检测VmhA基因的扩增时长结果

2.2 RPA检测方法的特异性评价

VmhA的RPA特异性评价结果显示，拟态弧菌能够扩增到467bp的特异性条带，其他10株标准菌株：创伤弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、哈维氏弧菌、沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌均未检测到该产物，说明该方法具有较强的特异性（图2）。

图2 VmhA基因的RPA特异性检测结果

2.3 RPA检测方法的灵敏度比较

对比VmhA的普通PCR方法与RPA检测方法的灵敏度，检测结果显示（图3、图4），当普通PCR反应设置30个循环，模板DNA含量为0.1 ng时，可以检测到106 bp的目的条带；当RPA检测方法反应时间设置40 min，模板DNA含量为0.1 ng时，也可以检测467 bp的目的条带；当DNA含量为0.01 ng时；两种方法均未能检测到目的条带，说明RPA和普通PCR的灵敏度一致。

图3 VmhA基因RPA检测的灵敏度

图4 VmhA基因PCR检测的灵敏度

2.4 RPA检测方法的应用效果

应用本研究建立的RPA检测体系，对本机构2016年检测的20份阳性检出留样、其中拟态弧菌确认阳性检出2份和30份阴性留样进行了复检，结果共有2份样本检出拟态弧菌，该留样检测结果与之前传统培养及生化鉴定的结果完全一致，表明该方法具有较好的应用效果。

3 讨论

RPA技术是近些年兴起的常温扩增技术，目前在病毒、病原菌及转基因的检测中均有成功的应用[8-14]，但尚未见拟态弧菌的相关研究报道。本研究建立了针对拟态弧菌特异性VmhA基因的RPA检测方法，并对该方法进行了应用测试，结果显示该方法特异性强，灵敏度与普通PCR相当，可较好应用于水生动物及其加工产品的检测，且反应耗时短、对设备依赖程度低，适合现场及基层单位检测应用，为拟态弧菌的疫情监控、污染监测等提供了更为简便高效的解决手段。

研究表明，拟态弧菌的致病性是由黏附素、溶血素、肠毒素等多种毒力因子共同作用的结果，拟态弧菌不耐热溶血素由VmhA基因编码，该基因在拟态弧菌的临床及环境分离的菌株中高度保守，且与与霍乱弧菌溶血素编码基因的同源性较高，所以也是核酸检测、蛋白表达及抗体制备等方面的研究热点[5，15-16]。本研究亦是基于VmhA基因保守序列建立了RPA检测方法，在特异性、灵敏度及应用检测方面上也均能满足实际检测要求。

RPA技术最大的优点在于反应条件在37℃恒温反应，不需要进行复杂的反应参数优化，本研究对比测试不同反应时长的扩增效果，发现在40 min时扩增产物基本可满足检测需求，考虑时效性及污染防控，未选用扩增更长但可能更灵敏的反应参数。本文所用的PCR仪、核酸蛋白分析仪及凝胶成像分析系统并非RPA检测的必须仪器设备，有研究表明，使用金属浴、分光光度计及简易凝胶观察设备也可完成RPA检测[17-18]，故该方法适用于现场及基层检测。此外，RPA技术反应温度接近人体温，可不依赖PCR扩增仪。有研究人员利用该特性建立了一种仅仅利用人体体温即能完成DNA扩增的RPA检测方法[19]，显著拓展了该技术的应用条件。

灵敏度是评价检测方法优劣的一个关键参数，本研究建立的RPA技术用于检测VmhA方法，其灵敏度和普通PCR方法相当，此前报道也证明该技术与已报道的LAMP检测灵敏度一致[20-21]。但是RPA技术相比传统PCR有着反应更为快速（仅需30～40 min）、不依赖PCR仪，而对比LAMP有着引物设计难度小、产物片段单一且可测序确证的优点便于后续进行测序确证。所以RPA技术在基层实验室和现场检测中有着更高的实用价值。

同PCR方法一样，RPA技术也是扩增检测特定基因序列，该序列与目标菌的性状及行为表现并无必然的对应关系，当目标菌数量较少、活力较弱时，使用传统微生物检验方法不一定能检出为阳性，故在应用检测中可能存在假阳性问题[22]。本研究建立的RPA检测方法，对本机构50份留样的应用检测并未发现假阳性问题，可能与研究的样本数量偏小有关。

当然，RPA技术作为一种后起的检测手段，也有不足之处需要完善。首先是RPA体系对于蛋白酶活性要求比较高，需要保证体系中的各种酶促反应的准确进行，其技术的提升依赖现代酶学的发展应用；其次，RPA扩增体系中存在大量蛋白酶，故直接电泳无法分辨出目的核酸片段，必须经过纯化去除系统内所含的蛋白质[7]；另外，RPA试剂为英国剑桥Babraham学院成立的TwistDx公司独家研发销售，试剂售价相对较高，但目前国内已有公司成功开发了类似替代产品，相信随着市场的扩大与成熟，其检测成本也会越来越低。作为一种新兴的核酸扩增技术，RPA具有特异性强、灵敏度高、操作快速便捷等明显优势，是现今呼声最高的“一种可替代PCR的技术”，在病原体检测及食品安全等众多领域已经有了越来越多的推广应用，技术发展及应用前景均较为广阔。