两相体系中全细胞转化法制备托莫西汀中间体

， ，泮佳

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

儿童注意缺陷多动障碍(Attention deficit hyperactivity disorder，ADHD)是一种儿童时期常见的神经精神障碍，在学龄儿童中的发病率高达6%～10%，主要表现为注意力分散、活动过度和冲动[1].盐酸托莫西汀(Atomoxetine hydrochloride，ATX)是目前唯一获FDA批准可用于ADHD儿童、青少年与成人患者的非神经系统兴奋剂药[2].

(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯是(R)-托莫西汀的重要中间体，可通过微生物转化法制备[3].微生物转化法反应条件温和、副反应少、收率高、光学纯度高和环境友好[4-5].对于需要辅酶参与的合成反应，采用添加低廉的碳源或醇类的方式，就可实现辅酶的再生[6].同时，利用磷酸盐缓冲液/有机溶剂两相体系，扩大了难溶于水的底物3-羰基-3-苯基丙酸乙酯的溶解度，提高底物的利用率.这一过程中最关键的是确定合适的有机溶剂和磷酸盐缓冲液组成的两相体系.在两相体系中，有机溶剂对微生物的毒害作用，可导致细胞失活和酶结构破坏，影响生物催化的进行.研究了在磷酸盐缓冲液/有机溶剂两相体系中，以热带假丝酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016作为催化剂，不对称还原3-羰基-3-苯基丙酸乙酯制备(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯的过程.考察了不同有机溶剂对CandidatropicalisCGMCC NO.15016的细胞毒性，以及对细胞不同生长期的毒性和底物对微生物代谢的影响.在此基础上，笔者详细探讨了不同有机溶剂对底物的转化率以及产物对映体过剩值的影响，同时对影响反应的各种因素例如相体积比、辅助底物、磷酸缓冲液pH、温度、菌体浓度和底物浓度等条件进行优化[7-9]，最终确定了最佳反应条件.

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 种

热带假丝酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016，由本实验室从浙江工业大学校园土壤中筛选得到，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心.

1.1.2 培养基

斜面培养基：葡萄糖20 g/L，硫酸铵1 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾1.5 g/L，氯化钠1 g/L，硫酸镁0.1 g/L，琼脂20 g/L.

种子培养基：葡萄糖46 g/L，酵母汁25 g/L，磷酸二氢钾4 g/L，磷酸氢二钾4 g/L，氯化钠0.1 g/L.

发酵培养基：葡萄糖46 g/L，酵母汁25 g/L，磷酸二氢钾4 g/L，磷酸氢二钾4 g/L，氯化钠0.1 g/L.

1.2 方 法

1.2.1 培养方法

斜面培养：30 ℃，恒温培养箱培养3～5 d.

种子培养：将斜面接入装液25 mL种子培养基的100 mL三角锥形瓶中，于30 ℃，120 r/min恒温摇床中培养24 h.

发酵培养：将已培养24 h的种子液，以10%的接种量接入装液250 mL发酵培养基的1 000 mL三角锥形瓶中，于30 ℃，120 r/min恒温摇床中培养24 h.

1.2.2 有机溶剂对细胞毒性的检测方法

DNS溶液的配制：3,5-二硝基水杨酸，1%；苯酚，0.2%；亚硫酸钠，0.05%；氢氧化钠，1%；酒石酸钠钾，20%.配制好DNS溶液，将其保存在棕色瓶中避光稳定一周后使用[10].

代谢活力保留值(Metabolic activity retention，R%)计算方法：称取干重为0.5 g的经过离心获得的湿菌体于50 mL锥形瓶中，加入10 mL无菌水和10 mL有机溶剂，称取干重为0.5 g的经过离心获得的湿菌体于50 mL锥形瓶中加入20 mL无菌水作为对照组，在30 ℃，120 r/min恒温摇床中培养24 h后离心，弃去上清液得菌体沉淀，将菌体沉淀加入20 g/L的10 mL葡萄糖溶液中培养4 h后，离心取上清液.用DNS法测葡萄糖浓度，将其与初始葡萄糖浓度相比，得到耗糖量.微生物细胞的代谢活力保留定义[11]为

R=(R1/R2)×100%

(1)

式中R1，R2分别为两相体系中和无菌水中培养24 h的菌体在葡萄糖溶液中培养4 h时的耗糖量.细胞的代谢活力保留值R的大小可用来表征有机溶剂的毒性大小，其值越大，说明该有机溶剂对微生物细胞的毒性越小，其生物相容性越好.

1.2.3 3-羰基-3-苯基丙酸乙酯制备(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯的分析方法

采用岛津GC-2014气相色谱仪检测产物和底物的浓度.GC检测条件：手性柱 supelcoβ-120(250 mm×2.5 mm)；进样量1 μL；柱温125 ℃；进样口温度250 ℃；检测口温度255 ℃；载气为氮气；载气流量2 mL/min；分流比1∶15；检测器为氢火焰离子化检测器(FID).

底物3-羰基-3-苯基丙酸乙酯和产物(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯的出峰时间分别为17.815 min和27.182 min，如图1所示.

图1 底物和产物的气相色谱图Fig.1 Gas chromatography of the substrate and product

1.2.4 数据处理方法

底物摩尔转化率的计算式为

(2)

式中：P为反应结束时产物的质量；Mp为产物的分子量；Ms为底物的分子量；q为反应初始时底物的质量.

产物对映体过剩值的计算式为

(3)

式中：CR为R-构型产物的摩尔浓度；CS为S-构型产物的摩尔浓度.

2 结果与讨论

2.1 有机溶剂对Candida tropicalis CGMCCNO.15016毒性研究

2.1.1 葡萄糖标准曲线

准确配制0.2～1.6 g/L质量浓度的标准葡萄糖溶液，测定550 nm处的吸光度，在相同条件下绘制出吸光度随葡萄糖质量浓度变化的曲线图,如图2所示.

图2 葡萄糖标准曲线Fig.2 Standard curve of glucose solution

2.1.2 不同有机溶剂对细胞的毒性

选用9种有机溶剂探讨了热带假丝酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016在磷酸盐缓冲液和这些有机溶剂组成的两相体系中培养24 h后的细胞代谢活力.细胞的代谢活力保留值R越大，说明该有机溶剂对微生物细胞的毒性越小，生物相容性越好，实验结果如表1所示.热带假丝酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016细胞在邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二辛酯中的糖代谢活力保留值最高，均达到了100%以上，说明这些有机溶剂对细胞的毒性小，生物相容性高.

表1不同有机溶剂中细胞代谢活力值

Table1Cellularmetabolicactivityvaluesindifferentorganicsolvents

溶剂logPR/%正己烷3.5068.1正庚烷4.0075.2邻苯二甲酸二乙酯3.3061.9邻苯二甲酸二丁酯5.40100.4邻苯二甲酸二辛酯9.60100.1乙酸乙酯0.649.8正丁醇0.808.3正辛醇2.9037.3乙酸丁酯1.7015.4

2.1.3 细胞的代谢活力与log P值关系

有机溶剂的logP值是有机溶剂在1-辛醇与水中的分配比的对数值，是有机溶剂的特征参数[12].logP值越大，说明疏水性越强，反之亦然.为了直观反映logP值与细胞代谢活力的关系，以表1中logP值为横坐标，以R为纵坐标绘制两者关系图.图3表明：细胞的代谢活力与logP值的关系大体呈S型曲线.细胞在logP<2的有机溶剂中时，细胞的代谢活力很低；细胞在logP为2～4的有机溶剂中时，具有中等的代谢活力值；当细胞在logP>4的有机溶剂中时，细胞的代谢活力能达到85%以上，说明该有机溶剂对细胞的毒性较小，具有良好的生物相容性.因此，可以用logP来衡量有机溶剂对热带假丝酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016细胞的毒性和生物相容性.

图3 有机溶剂log p值与细胞代谢活力的关系Fig.3 Relationship between the logP value of organic solvent and the cell metabolic activity

2.1.4 有机溶剂对不同生长期细胞的毒性

考察了热带假丝酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016不同生长期(3个)的细胞在磷酸盐缓冲液/有机溶剂两相体系的细胞代谢活力，3个时期分别为生长期(24 h)、稳定期(40 h)和衰退期(60 h)，实验结果如表2所示.处于生长期的细胞的代谢活力值都比稳定期和衰退期的低，而稳定期和衰退期的细胞代谢活力值变化不大.

表2有机溶剂对不同生长期细胞的代谢活力的影响

Table2Influenceofthedifferentorganicsolventsonmetabolicactivityofcellsatdifferentgrowthphase

培养时间/hR/%正丁醇乙酸丁酯邻苯二甲酸二丁酯正己烷正庚烷246.110.987.954.463.74011.718.398.675.584.86014.223.1101.380.678.7

2.1.5 底物对细胞代谢活力的影响

研究了在3-羰基-3-苯基丙酸乙酯的不同质量浓度下，热带假丝酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016的细胞代谢活力值.由图4可知：质量浓度对细胞代谢有一定的影响，底物的质量浓度越高，细胞的代谢活力值越小，说明高质量浓度的底物对细胞的毒性更大.

图4 不同底物质量浓度对细胞代谢活力值的影响Fig.4 Influence of various concentration of substrate on metabolic activity of cells

2.2 Candida tropicalis CGMCC NO.15016不对称还原转化条件优化

2.2.1 有机溶剂的选择

选择合适的有机溶剂是两相体系中进行生物催化的关键，实验中研究了不同有机溶剂和磷酸盐缓冲液组成的两相体系中的生物催化效果，结果如表3所示.在邻苯二甲酸二丁酯和磷酸盐缓冲液组成的两相体系中转化率达到了最大值，同时邻苯二甲酸二丁酯对热带假丝酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016毒性较小.在各个不同有机溶剂中得到的产物(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯的e.e.值均为100%.选择了磷酸盐缓冲液/邻苯二甲酸二丁酯两相体系作为后续实验的反应介质.

表3 不同有机溶剂对反应的影响Table 3 Effect of various organic solvents on reduction %

2.2.2 不同相体积比对反应的影响

考察了磷酸盐缓冲液/邻苯二甲酸二丁酯不同体积比对底物转化率和产物对映体过剩值的影响，实验结果如图5所示，其中：Va为水相的体积；Vb为邻苯二甲酸二丁酯的体积.随着邻苯二甲酸二丁酯体积的不断增加，转化率随之增加，当Va∶Vb=1∶1时，转化率达到了最大值，之后随着有机溶剂的增加转化率大幅度下降.在各个不同相体积比下得到的产物(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯的e.e.值均为100%.磷酸盐缓冲液与邻苯二甲酸二丁酯两相体系最适宜的相体积比为1∶1.

图5 不同相体积比对反应的影响Fig.5 Effect of volume ratio on reduction

2.2.3 不同辅助底物对反应的影响

不对称还原3-羰基-3-苯基丙酸乙酯制备(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯的过程反应式为

(4)

不对称还原过程中，添加辅助底物有利于辅酶的再生和循环利用.因此，研究了体积分数分别为0%，2%，4%，6%，8%，10%的异丙醇、乙醇、甘油和葡萄糖作为辅助底物对反应转化率的影响，实验结果如图6所示.加入葡萄糖和乙醇为辅助底物时，转化率都有所提高，且乙醇比葡萄糖对反应转化率的影响更大，加入8%的乙醇最有利于辅酶的再生，辅酶再生机理见式(4).乙醇在酵母细胞中的乙醇脱氢酶作用下生成乙醛，脱下的H+转移给NAD+生成NADH.在添加不同种类及不同添加量的辅助底物的情况下，得到的产物(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯的e.e.值均为100%.故8%添加量的乙醇是最适宜的辅助底物.

图6 不同体积分数辅助底物对反应的影响Fig.6 Effect of co-substrate on reduction

2.2.4 不同温度对反应的影响

在最佳的反应温度下，菌体细胞可以表现出很高的催化活性.考察了在20～40 ℃时温度对底物转化率和产物对映体过剩值的影响，实验结果如图7所示.当温度由20 ℃增加到36 ℃时，转化率明显增大；当温度超过36 ℃时，随着温度的继续升高，转化率开始下降.在各个不同温度下得到的产物(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯的e.e.值均为100%.选择最佳的反应温度为36 ℃.

图7 不同反应温度对反应的影响Fig.7 Effect of temperature on reduction

2.2.5 磷酸盐缓冲液pH不同对反应的影响

研究了磷酸盐缓冲液pH的范围在3～8，不同pH的缓冲液对酶促反应的影响，实验结果如图8所示.当pH由3增加到6时，底物的转化率不断增大；当pH超过6时，转化率不断降低.该结果表明磷酸盐缓冲液pH=6时细胞具有较大的催化活性.在各个不同pH下得到的产物(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯的e.e.值均为100%.磷酸盐缓冲液/有机溶剂两相体系中缓冲液最适宜的pH=6.

图8 不同pH对反应的影响Fig.8 Effect of pH value on reduction

2.2.6 不同菌体质量浓度对反应的影响

保持底物的摩尔浓度不变，考察了菌体质量浓度对反应转化率和对映体过剩值的影响，实验结果如图9所示.当菌体质量浓度不断增加时，底物的转化率随之增大，菌体质量浓度超过30 g/L时，转化率不再改变.因此，最佳的菌体质量浓度(菌体干重/反应液体积)为30 g/L.在不同菌体质量浓度下得到的产物(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯的e.e.值均为100%.

图9 不同菌体质量浓度对反应的影响Fig.9 Effect of cell concentration on reduction

2.2.7 不同底物浓度对反应的影响

研究了不同浓度的3-羰基-3-苯基丙酸乙酯(0.024～0.075 mol/L)对还原转化率和产物对映体过剩值的影响，实验结果如图10所示.当底物的浓度由0.024 mol/L增加到0.050 mol/L时，转化率均能达到100%.当浓度高于0.050 mol/L时，转化率明显降低，当底物浓度为0.062，0.075 mol/L时，转化率分别仅有65.3%，55.7%.这是由于底物的生物相容性差，同时高浓度的底物会对细胞产生毒性.因此，最适宜的底物浓度为0.050 mol/L.

图10 不同底物浓度对反应的影响Fig.10 Effect of the substrate concentration on reduction

2.3 两相体系与单一水相体系的比较

将2.2中得到的最优反应条件和单一水相的反应条件进行对比，以转化率作为研究目标比较两相体系和单一水相体系的优势，实验结果如图11所示.磷酸盐缓冲液/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中，底物质量浓度可达到 9.6 g/L，转化率能达到100%，而在单一水相中，随着底物质量浓度的增加，转化率却随之不断降低，单一水相中最适底物质量浓度为4.8 g/L，转化率最高为82.7%.由图11可知：磷酸盐缓冲液/邻苯二甲酸二丁酯两相体系作为反应介质能增加底物3-羰基-3-苯基丙酸乙酯的利用率，提高其转化率.

图11 两相体系和单一水相中转化率的比较Fig.11 Comparation of conversion in single aqueous phase and diphasic system

3 结 论

在磷酸盐缓冲液/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中，热带假丝酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016不对称还原3-羰基-3-苯基丙酸乙酯制备(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯的效果最佳.以1∶1的磷酸盐缓冲液与有机溶剂的体积比，30 g/L的菌体质量浓度(菌体干重/反应液体积)，0.05 mol/L的底物浓度，8%添加量的乙醇作为辅助底物，磷酸盐缓冲液pH=6，并在36 ℃，120 r/min恒温振荡培养箱中反应48 h，转化率及对映体过剩值均可达到100%.与单一水相相比，底物质量浓度提高至9.6 g/L，转化率提高了17.3%.这充分说明了磷酸盐缓冲液/有机溶剂两相体系可以解除单一水相体系中底物和产物的抑制作用，大大提高了反应效率.