Toll样受体9基因多态性与湖北汉族系统性红斑狼疮易感性的关系

邢亚琼 吴雪菁子 宋继权

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种慢性进行性自身免疫性疾病，常累及人体多个器官及系统，预后较差[1]。SLE病因复杂，经大量研究显示与遗传、环境、内分泌、感染等各种内外因素均相关[2]，但一般认为其他因素均是在遗传因素异常的基础上发生，遗传因素在疾病的易感性和临床表现上起着不可替代的作用。因此，在研究SLE易感性时，对人体全基因组易感基因位点的分析不容忽视。SLE的致病机制与以B淋巴细胞的活化、增值、功能亢进为中心的体液免疫及细胞免疫紊乱息息相关[3]。Toll样受体(TLRs)是一种识别先天免疫模式的蛋白质家族。它们广泛地表达在人体的各种组织和细胞中，并且能够识别并结合保守的病原体相关分子，继而触发一系列的信号转导通路，导致炎症介质的释放，从而激活获得性免疫。TLRs被认为是先天免疫和后天免疫之间的桥梁[4]。日本学者Hemmi等[5]在2000年通过BLAST搜索、实验等首次发现TLR9。随后相继有研究证实B淋巴细胞仅表达TLR9和TLR10。其中，TLR9通过与DNA中胞嘧啶磷酸鸟苷基因序列(CPG DNA)特异性结合进而激活免疫细胞B淋巴细胞并使其快速增殖，产生大量抗双链DNA抗体；同时调控获得性免疫应答，产生多种细胞因子[6,7]。综上可见TLR9在SLE发病中发挥着重要作用。然而，查阅近年来的文献，发现对TLR9基因多态性与系统性红斑狼疮相关性的研究报道数量并不多，且统计结果缺乏一致性[8-11]。因此，本文通过对人外周血DNA测序分析在湖北汉族人口中Toll样受体9基因多态性(rs187084、rs352140)与SLE的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 80例SLE患者资料收集于2015年6月至2017年12月武汉大学中南医院及湖北省人民医院门诊及住院部患者，均为湖北汉族女性，平均年龄为36岁。纳入标准符合1997年美国风湿协会修订的SLE诊断标准。健康对照组84人，收集于我院体检中心，各项检查指标均正常的人群，平均年龄为32岁，且排除了SLE、类风湿性关节炎、皮肌炎等自身免疫性疾病及相关家族史。所有研究对象间均无血缘关系。本研究已通过武汉大学中南医院伦理委员会批准，并在实施过程中遵守赫尔辛基宣言，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 5424台式离心机(Eppendorf公司)，S1000 Thermal Cycler PCR仪(美国BIO-RAD公司)，DYY-6C电泳仪(北京六一仪器厂)，Tanon1600凝胶成像系统(上海天能科技有限公司);2xTsingKe Master Mix(武汉擎科创新生物科技有限公司)，血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司DP318)。

1.3 实验方法 收集受试者清晨空腹静脉血5 mL于EDTA紫色抗凝管中于4℃保存。采用苯酚-蛋白酶K法提取外周血基因组DNA，采用紫外分光光度计测定DNA含量及浓度，A260/A280>1.8，并于-20℃保存。选取并合成位于rs187084、rs352140位点的目的基因合成引物，合成引物(见表1)由武汉擎科创新生物科技合成。扩增条件为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸30 s，35次循环，72℃延伸5 min。将PCR产物经2%琼脂糖凝胶(含溴乙啶)电泳，验证扩增结果后由武汉擎科创新生物科技有限公司通过SNaPshot法测序。

1.4 统计学方法 采用直接计数法分别对实验组和对照组进行等位基因和基因型频率进行统计，用SPSS 21.0软件进行χ2检验。SLE实验组及正常对照组间的等位基因频率及基因型频率进行卡方检验分析，P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验 分别对SLE实验组及对照组各基因型的频数及理论频数进行H-W平衡检验，2个位点在两组的分布均符合H-W平衡定律(P>0.05)，表明此次选取的样品符合遗传平衡定律，具有很好的代表性，可以代表总体人群。

2.2 基因型频率及等位基因频率 rs187084 AA,GG,AG基因型频率在实验组及对照组无显著统计学差异(P>0.05)。A,G等位基因频率在实验组及对照组无显著统计学差异(P>0.05)。rs352140 AA,GG,AG基因型频率在实验组及对照组无显著统计学差异(P>0.05)。A,G等位基因频率在实验组及对照组无显著统计学差异(P>0.05)。见表2、图1。

表1 PCR扩增引物序列

表2 rs187084、rs352140位点基因型及等位基因在实验组与对照组间的分布 例(%)

a b c d e f

注：a、b、c为rs352140位点测序结果，基因型分别为AG、AA、GG；d、e、f为rs187084位点测序结果，基因型分别为AG、AA、GG

图1 基因测序图

3 讨论

SLE的发病机制及病因并不十分明确。然而统计发现SLE有家族聚集性，且同卵双生子与异卵双生子的发病率不同。众多研究者经全基因组关联分析(Gemone wide associated studies，GWAS)发现超过60个与SLE相关的易感基因位点，其中一些基因位点对早期B细胞的发育及B细胞表面受体的信号传导有重要影响[12,13]，表明遗传因素在SLE的发生及发展中起到了一定的作用。另有研究者将SLE患者功能障碍的间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)在体外培养仍显示免疫调节功能受损，然而基因敲除候选易感基因后，MSC相应的功能恢复[14,15]，由此进一步证实了遗传因素与SLE的相关性。

TLR9在自身免疫性疾病发病机制中的作用得到了人们越来越多的关注。TLR9是toll样受体家族中的重要一员，主要表达于浆细胞样树突状细胞(pDC)、记忆性B细胞等免疫细胞[16]。一直以来，人们认为TLR9仅能与细菌、病毒等微生物中的DNA胞嘧啶磷酸鸟苷基因序列(CPG DNA)形成的配体结合。近来，研究者们陆续发现人类真核细胞线粒体DNA(mtDNA)中保留着类似细菌DNA的分子序列，其中不被甲基化修饰的CPG序列可以作为TLR9的配体，经结合后作用于免疫细胞，继而诱导免疫应答[17]。也有研究证实，SLE患者体内凋亡和/或清除缺陷的血浆DNA与自身抗体结合形成的免疫复合物结合pDCs表面的FcγRIIa,继而与胞内的TLR9结合，刺激pDCs释放干扰素IFN-α，激活pDCs更高效的对自身反应性T淋巴细胞进行抗原提呈。同时免疫复合物在BCR/TL9的参与下激活B淋巴细胞，导致B淋巴细胞产生大量自身抗体。这些自身抗体又参与了免疫复合物的形成，产生的免疫复合物又可以充当TLR9的激动剂从而继续下一个循环[18-21]。Chow等[22]通过小鼠动物实验发现TLR9是toll样受体9/转化生长因子β1/血小板源性生长因子B(TLR9/TGF-β1/PDGF-B)通路的重要角色，介导骨髓巨噬细胞的一种信号级联反应。随后Yuan等[23]为探讨TLR9/TGF-β1/PDGF-B通路在SLE患者原代细胞中的是否存在，及与健康人群是否存在差异，实验发现CpG序列可诱导SLE患者细胞中TGF-β1mRNA和PDGF-BmRNA水平明显高于健康人群组。有研究说明TLR9在TLR9/TGF-β1/PDGF-B炎症通路中扮演着重要角色，并且与SLE相关。Liu等[24]将表达Epstein Barr病毒膜抗原BLLF1的21只转基因雌性小鼠随机分为空白对照组、B淋巴细胞刺激因子(BLYS)抑制组和TLR-9抑制组，持续治疗10天后，采集外周静脉血，检测TLR-9 mRNA的相对水平，BLYS和IL-10蛋白浓度水平，结果发现BLYS抑制与TLR9抑制组比较，TLR9 mRNA和BLYS蛋白浓度这两项指标的差异有统计学意义(P<0.05)，由此推测TLR9及其相关的信号通路可能对BLYS诱导的SLE和炎症免疫水平的调节有重要意义。Benigni等在实验中发现在狼疮性肾炎小鼠模型中TLR9与尿蛋白及肾小管损伤程度正相关，并认为可以通过外周B细胞TLR9的表达情况作为判断SLE患者疾病活动性及临床预后的指标[25-28]。以上这些研究及相关发现提示TLR9不仅参与免疫应答，并且在系统性红斑狼疮致病的相关炎症通路中发挥着至关重要的作用。

遗传，对决定疾病的易感性及临床表型起着关键作用，这是不可否认的事实。近年来研究表明TLR9多个单核苷酸多态性(SNP)位点的基因多态性参与了多种疾病的发生发展过程，包括肿瘤性疾病、感染性疾病、免疫相关性疾病等[29,30]。人类TLR9基因位于3号染色体p21.3,是SLE的易感基因位点之一，在TLR9的单核苷酸多态性基因位点中，rs187084位于启动子区，rs352140位于第2个外显子区，故其多态性可能影响TLR9的功能，参与SLE疾病的发生、发展。Huang等[8]研究发现rs187084基因多态性，与台湾系统性红斑狼疮病人相关。Tao等[9]研究发现rs352140位点基因多态性与中国人口中系统性红斑狼疮的易感性相关。然而，有研究发现在韩国SLE患者中TLR9基因多态性与系统性红斑狼疮无相关性[10]。Piotrowski等[11]在波兰籍人群中随机抽取254例系统性红斑狼疮患者及521例健康志愿者，检测其外周血中TLR9 的rs352140位点基因多态性，结果无统计学差异。综上说明，目前对Toll样受体9基因层面的研究较少，且研究结果不一致。

本次研究中为探究TLR9基因位点多态性与湖北汉族人群系统性红斑狼疮的疾病易感性的关系，我们通过观察80例系统性红斑狼疮患者和84名健康对照，选择2个SNP位点(rs187084、rs352140),采用SNaPshot方法对DNA样本SNP位点进行分析，结果显示 rs187084、rs352140位点基因型频率和等位基因在实验组和对照组中均无显著统计学差异(P>0.05)。本实验结果提示可能上述两个SNP位点与SLE的发病机制不相关。

本次实验初步探讨了TLR9基因多态性与SLE疾病易感性的关系。结果提示rs187084、rs352140位点的单核苷酸多态性与湖北汉族系统性红斑狼疮的易感性可能不相关。另外，本实验在TLR9的基因位点中仅选择了2个位点，不排除其他位点在实验组及对照组中表达有差异的可能。同时本次实验中选取的样本量小，地域范围较局限，故在基因层面还有待于进一步探讨。