基于GEO数据库及生物信息学方法筛选食管癌放射抗拒关键基因及通路*

郭亚，马红兵， 王中卫 ,王宝峰， 金迎迎， 何赟，崔颖涛

710004 西安, 西安交通大学第二附属医院 肿瘤科

食管癌是常见的恶性肿瘤之一，发展迅速且预后较差。放射治疗是食管癌治疗主要手段之一，而放射抗拒是肿瘤复发与转移的重要因素之一[1-4]。因此，研究食管癌放射抗拒相关标志物对提高食管癌放射敏感性具有重要意义。生物信息学是由多学科交叉产生的学科。近年来，运用生物信息学方法通过在分子水平上进行数据挖掘，为研究各种疾病的分子机制提供了新的思路[5-8]。本研究通过收集GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中与食管癌放射抗拒相关的芯片数据，对食管癌放射抗拒相关基因进行挖掘，并进行生物信息学分析。

1 材料与方法

1.1 基因表达数据

以Esophageal cancer和radioresistance为关键词在GEO数据库中检索与食管癌放射抗拒相关的mRNA表达谱数据。选择GSE61686芯片数据进行挖掘，该数据由Chen等[6]提供。6个样本构成分别是：GSM1514923，GSM1514924，GSM1514925，GSM1514926，GSM1514927，GSM1514928。其中，GSM1514923，GSM1514924，GSM1514925是放射敏感组,GSM1514926，GSM1514927，GSM1514928是放射抗拒组。

1.2 差异表达基因筛选

利用Morpheus软件进行差异表达基因筛选。首先输入网址https://software.broadinstitute.org/morpheus，导入数据，选择样本编号点击右键Annotate Slection进行样本注释，选择Marker Slection进行分组，最后进行t检验分析，最终获得差异表达基因热图。

1.3 差异表达基因生物信息学分析

采用Panther(http://www.pantherdb.org/tools/index.jsp)在线分析软件对筛选出的差异基因进行生物学注释、信号通路富集注释。将筛选的差异基因输入STRING(http://www.string-db.org)数据库进行分析，找出差异基因的对应蛋白之间的可能作用关系，构建相互作用网络结构图。

2 结 果

2.1 差异表达基因的筛选

在GEO中获得GSE61686芯片数据，经过Morpheus软件分析后获得199个差异表达基因与食管癌放射抗拒相关，其中上调表达基因99个，下调表达基因100个(图1)。

图1 Morpheus软件筛选出的食管癌放射抗拒相关差异基因Fig.1 Radioresisntant genes in esophageal cancer screened out by using Morpheus software

2.2 差异基因的生物学过程及参与的信号通路分析

将199个差异基因导入Panther在线分析软件中发现,这些基因主要参与了12个生物学过程。主要涉及代谢、刺激反应、细胞黏附、细胞再生及免疫等过程(见图2)。

图2 Panther软件分析差异基因参与的生物学过程Fig.2 Differentially expressed genes engaged biological processes analyzed by Panther software

如表1所示，Panther在线分析软件对差异基因进行Pathway分析：差异基因主要与23条信号通路相关，主要涉及凋亡信号通路、细胞周期、FGF信号通路、白介素信号通路、血管生成相关信号通路、整合素信号通路、由趋化因子及细胞因子介导的炎症信号通路等。基因NFKBIA参与凋亡、细胞因子及趋化因子介导的炎症信号通路、T细胞和B细胞活化通路、CCKR信号通路及Toll受体信号通路等多个信号通路。

表1 差异表达基因的信号通路分析Table 1 Signal Pathway analysis of differentially expressed genes

2.3 差异基因间互做网络分析

将199个差异基因导入String在线分析软件发现：这些差异基因间存在相互作用，其中基因ZWINT和NUF2、EMC4与EMC7、LCMT1和PPP2R2C、CYFIP1和MAPK4间、KCNC2和KCNS3、TGM2和PGD、ABR和ARHGAP20、ARSD和SULF2间互做关系较为密切，这些相互作用的基因编码蛋白可能调控食管癌放射敏感性,见图3。

图3 差异基因的互作网络分析

Fig.3 The protein-protein interaction of differentially expressed genes

3 讨 论

放射治疗是食管癌的重要治疗方式之一，放射抗拒是提高食管鳞状细胞癌放射敏感性的最大障碍之一[9-11]。因此，寻找食管癌放射敏感性相关标志物，进一步在分子水平探讨食管癌放射抗拒发生机制，鉴定食管癌放射抗拒相关的信号通路及关键基因,对于提高食管癌放射敏感性具有非常重要的意义。

新陈代谢是机体生命活动的基本特征，包括物质代谢和能量代谢。细胞的能量主要来自糖代谢。葡萄糖在体内氧化分解的途径包括糖酵解和氧化磷酸化[12]。研究表明高剂量辐射通过氧化应激及DNA损伤反应引起能量代谢功能改变，主要有DNA及氧化降解产物蓄积、谷胱甘肽及NADH丢失及DNA损伤修复所必需前体物质[13]。头颈部鳞癌细胞放射抗拒发生与能量代谢的再分布有关，表现为增加葡萄糖的再摄取，减少脂肪酸摄取；放射抗拒细胞生长更多依赖于葡萄糖代谢[14]。抑制糖酵解有可能提高细胞放射敏感性，沉默HIF表达及抑制糖酵解途径可以提高放射敏感性[15-16]。抑制MCT1表达可以减少乳酸转运从而提高放射敏感性[17]。Shen等[18]研究发现：U87GBM细胞经放射线处理后，检测到糖酵解相关基因表达上调，放疗可促进糖酵解，DCA逆转糖酵解过程可以提升GBM对放疗的敏感性。课题组前期研究发现：能量代谢相关基因在放射抗拒细胞CNE-2R中高表达；这些能量代谢相关基因可能与鼻咽癌放射抗拒发生相关[19-20]。本研究基于GEO数据库及生物信息学方法筛选出食管癌放射抗拒相关差异基因199个，参与能量代谢差异基因50个，其余差异基因主要涉及应激反应、免疫过程、细胞黏附、细胞再生等生物学过程。基于以上研究基础，笔者推测放射抗拒发生可能与能量代谢相关基因有关，具体机制仍需进一步研究。

放射抗拒的发生涉及多种复杂因素，如DNA损伤修复、细胞再增殖、细胞凋亡、细胞周期再分布、细胞乏氧、放射抵抗相关信号通路的激活等过程[21]。邱琪等[22]研究发现：食管癌干细胞放射抗拒发生涉及凋亡、增殖及多种分子信号通路改变。研究表明,Wnt/β-catenin、Hedgehog、EGFR、NF-κB通路与食管癌放射抗拒发生密切相关，开发这些关键通路的有效拮抗剂可为增强食管癌放射敏感性研究开辟新思路[23]。本研究筛选出的差异基因主要与23条信号通路相关，进一步说明食管癌的放射抗拒机制复杂，涉及多个信号通路共同作用结果，故寻找食管癌放射抗拒关键通路，对增强食管癌放射敏感性具有重要意义。

核因子kappa B(nuclear factor kappa B,NF-KB)是在成熟的B淋巴细胞中发现的，在肿瘤的生长、细胞凋亡等方面起关键作用[24]。Deorukhkar等[25]也认为多种肿瘤放射抗拒都与NF-KB有关，抑制NF-KB通路就增加了肿瘤放射敏感性。激活NF-KB能抑制细胞凋亡，引发肿瘤细胞增殖、侵袭、转移、放化疗抵抗。Li等[26]认为NF-KB活化主要是通过其效应基因COX-2、cyclinD1、bcl-2家族、survivin等导致肿瘤的侵袭性生长及放化疗抵抗。车少敏等[27]研究表明：食管癌的放射抗拒与NF-KB密切相关，抑制NF-κB通路能增强放射敏感度。基于以上研究笔者推测，NF-KB活化能够抑制细胞凋亡，从而导致放疗抵抗，抑制NF-KB通路就增加了肿瘤放射敏感度。赵朝辉[28]研究提出：NFKBIA是NF-KB抑制剂，能抑制NF-KB激活，从而抑制NF-KB在肿瘤中的生物学功能。NFKBIA蛋白缺失抑制NF-KB活化能力，从而阻止肿瘤细胞凋亡。本研究中在放射抗拒细胞中NFKBIA表达降低，参与多个信号通路。NFKBIA可能是通过抑制NF-KB活化能力，从而阻止肿瘤细胞凋亡，最终引起食管癌细胞放射抗拒，其内在机制仍需进一步研究。

本研究基于String在线分析软件进行了差异基因对应蛋白互作分析，结果发现这些差异基因间形成了蛋白互作网络，进一步说明这些差异基因可能在功能上相关，且通过蛋白间相互作用共同参与食管癌放射抗拒的调控。基因ZWINT和NUF2、EMC4与EMC7、LCMT1和PPP2R2C、CYFIP1和MAPK4间、KCNC2和KCNS3、TGM2和PGD、ABR和ARHGAP20、ARSD和SULF2间互做关系较为密切。可能是食管癌放射抗拒相关的重要候选基因，然而这些研究结果仍需进一步深入研究。

食管癌患者放射敏感性存在显著的个体差异，研究发现在一定程度上食管癌放疗的疗效取决于肿瘤内在的生物学行为[29]。近年来，随着分子生物学的发展，肿瘤遗传或表观遗传学的改变可能是造成肿瘤放疗后疗效差异的主要原因[30]。目前研究显示多种标志物(P53、ERCC1、VEGF、EGFR、HIF-1、NF-KB、COX2、LC3A、HMGA2等)和食管癌放射敏感性及预后相关[31-34]。陈博[35]采用免疫组化方法检测行单纯放射治疗的106例食管鳞状细胞癌患者肿瘤组织标本中COX2蛋白、E6FR蛋白表达水平，分析这两种蛋白表达水平与食管癌放射敏感性及单纯放疗预后的关系。结果表明：EGFR和COX2同时过表达与食管癌放射治疗不良预后相关，同时也可以作为判断食管癌放射敏感性的指标。有研究表明：FOXM1在食管鳞癌中的表达增加，其表达水平与病人预后呈负相关；FOXM1基因沉默可显著增强细胞放射敏感性，因此，FOXM1有可能成为食管鳞癌的治疗靶点[36]。UHRF1基因可能是与放射敏感性有关的新基因,研究采用免疫组化方法检测单纯放疗的食管鳞癌UHRF1表达变化与放疗疗效间的关系，发现UHRF1表达与近期放疗疗效存在一定的相关性，放疗反应越差者，表达水平越高[37]。RUNX3是胃肠肿瘤抑制分子，参与TNF-β介导凋亡。RUNX3与食管癌放射敏感性相关，表达RUNX3组预后较好[38]。本研究筛选出部分差异基因如(NFKBIA、RUNX3、NUF2、HMGA2等)与食管癌放射抗拒相关，这与以往研究相符，仍需后续实验进一步证实。

综上所述，本研究基于GEO芯片数据进行食管癌放射抗拒关键基因及信号通路的生物信息学分析，筛选出199个差异基因及23条信号通路，可能与食管癌放射抗拒发生相关。其中基因NFKBIA可能与食管癌放射抗拒发生更为密切，其内在机制仍需进一步深入研究。本研究同时也说明利用生物信息学方法能有效分析基因芯片数据，食管癌放射抗拒的发生是多基因共同参与的结果，为寻找提高食管癌放射敏感性相关靶标提供新思路。

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