枯草杆菌干预金属器械经不同灭菌方式的时效性研究

刘媛媛, 史凌云, 阿不都克尤木·麦麦提依明, 李 钊, 杨 益

(新疆医科大学第一附属医院1消毒配送中心次供应室一部, 2关节外科, 3泌尿中心, 4护理部, 乌鲁木齐 830054)

低温过氧化氢等离子灭菌技术作为常用的灭菌方式主要应用于不耐热不耐湿器械的灭菌，具有快速、低温、无毒性残留等优点，近年来广泛应用于医院微创、腔镜医疗器械等手术器械的灭菌[1]。而压力蒸汽灭菌法作为另一种可靠的灭菌方法，适用于耐高温、耐高湿的医疗器械的灭菌，具有灭菌时间短和器械损伤小、灭菌蒸汽)安全等优点，被各级医院广泛使用[2]。由于医疗器械的消毒质量与医院感染控制水平密切相关，金属器械的灭菌质量受暴露时间，消毒方式，保存时间等多个因素影响[3-5]，故本课题组拟通过低温过氧化氢等离子灭菌器和脉动预真空压力蒸汽灭菌器灭菌技术探索金属器械清洁后最佳的暴露时间，以及不同消毒方式灭菌后器械最佳的有效存放时间，为不同条件下消毒供应室选择最佳的灭菌方式提供参考依据。

1 材料与方法

1.1金属器械的预处理选4 000件金属器械分别采用手工清洗和机械清洗。每组2 000件。手工清洗组：金属器械经初洗—酶洗—漂洗—终末漂洗，并将1∶15的特殊器械润滑油配置正确比例,90℃ 5 min，干燥毕至检查装区。机械清洗组：所有金属器械经预洗、多效清洗酶洗+超声清洗仪清洗、漂洗、终末漂洗、专用器械润滑油保养、干燥,程序毕由检查包装区人员将清洗架拖出舱门外进行检查包装。效果评价：(1)目测法：合格为无残留物质和明显污渍，表面光洁；不合格为有残留物质和明显污渍，表面不光洁。(2)蛋白清洗测试棒检测：采用3M protect M检测法进行检测，绿色为阴性，表示为无蛋白质残留，灰色或紫色为阳性，表示有蛋白质残留。(3)隐血试纸法:评估血液残留情况,检测区及控制区各出现一条色带为阳性；仅控制区出现一条色带为阴性。

1.2枯草杆菌黑色变种芽孢污染实验枯草杆菌黑色变种(ATCC 9372)芽孢(由军事医学科学院消毒检测中心提供)。将购买的干粉菌种采用1.0 mL胰蛋白胨肉汤培养基(TryptoneSoja Broth，TSB)配制，制成菌悬液；取该菌各200 μL分别接种在胰蛋白胨大豆营养琼脂培养基上于37℃培养经鉴定合格的菌株保存在芽孢悬液在-80℃冰箱长期保存。取0.02 mL 1×108～5×108cfu/mL枯草杆菌菌悬液分别在1、2、3、4 h各取100件滴染于检测合格的金属器械关节处及锐利面，用L型铂金丝涂匀，晾干。

1.3金属器械的消毒灭菌及其效果评价依据2008年版《医院消毒技术规范》[6]，采取低温过氧化氢等离子灭菌器和脉动预真空压力蒸汽灭菌器灭菌，过氧化氢等离子灭菌条件：温度54℃，过氧化氢注射压力5 000 Pa,灭菌时间24 min;压力蒸汽灭菌条件：压力0.22 MPa，温度135℃，灭菌时间为8 min。将待消毒金属器械每5把独立成包，用无菌棉拭子擦拭器械关节处及锐利面，反复涂抹，将棉拭子置于2.0 mL无菌生理盐水，经振荡器充分振荡后，吸取1.0 mL混悬液接种于平皿，37℃培养箱内培养，培养7 d，且每次做阴、阳性对照试验，阴性对照为涂抹的无菌生理盐水，阳性对照为枯草杆菌悬浊液，比较不同时间点污染的金属器械经不同灭菌方式灭菌的效果,以阳性对照有细菌生长，阴性对照及实验组均无细菌生长为灭菌合格。

1.4保存不同时间的金属器械的灭菌效果评价分别在3、6、8、10、12月随机抽样，每次每种消毒方式抽取100件金属器械进行枯草杆菌黑色变种芽孢的培养及三磷酸腺苷(ATP)检测。枯草杆菌黑色变种芽孢的培养同“1.2项”描述。ATP荧光检测法：经Clean-Trace型ATP荧光检测仪(美国3M公司)测量后得到荧光强度，以相对荧光强度(relative light units,RLU)表示，以测试值≤500 RLU/件视为合格。

1.5统计学处理3种方法检测清洗合格结果及金属器械在1、2、3、4 h后干预的灭菌效果属于计数资料，采用卡方检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1机械清洗和人工清洗方法效果的比较目测法结果显示，机械清洗组的合格率(98.1%)高于人工清洗组(88.6%)(P<0.05)。蛋白清洗测试棒法检测结果亦显示，机械清洗组的合格率(97.3%)高于人工清洗组(85.7%)(P<0.05)。隐血试纸法检测结果亦显示，机械清洗组的合格率(97.1%)高于人工清洗组(86.7%)(P<0.05)，结果见表1。

表1 机械清洗和人工清洗方法效果的比较

2.2金属器械在1、2、3、4h后干预的灭菌效果洁净金属器械在1～2 h内采取低温过氧化氢等离子灭菌器和脉动预真空压力蒸汽灭菌器灭菌均达到合格，3 h后压力蒸汽灭菌器灭菌效果达到94%，高于等离子灭菌器的91%，但差异无统计学意义(χ2=0.649，P=0.421)，而4 h后压力蒸汽灭菌器的灭菌效果(88%)显著高于等离子灭菌器(75%)，差异具有统计学意义(χ2=5.604，P=0.018)，结果见表2。

表2 金属器械在1、2、3、4 h后干预的灭菌效果比较/%

注: 与等离子灭菌比较，*P<0.05。

2.3不同灭菌方式的枯草杆菌灭菌效果评价经低温过氧化氢等离子灭菌器消毒的金属器械放置3个月及6个月后，均未见枯草杆菌黑色变种芽孢污染，有效期达到6个月。经脉动预真空压力蒸汽灭菌器灭菌的器械放置3个月、6个月、8个月后均未见枯草杆菌黑色变种芽孢污染，有效期为8个月，结果见表3。

2.4不同灭菌方式的ATP荧光检测合格率比较经等离子灭菌器和压力蒸汽灭菌器灭菌消毒的金属器械放置3个月及6个月后，均未见RLU值超标，但压力蒸汽灭菌器灭菌消毒的金属器械消毒放置8个月后，ATP荧光检测的合格率为97%，ATP荧光检测显示等离子灭菌器和压力蒸汽灭菌器灭菌消毒的金属器械有效期均为6个月，结果见表4。

表3 不同灭菌方式的枯草杆菌灭菌效果评价/%

表4 不同灭菌方式的ATP荧光检测合格率比较/%

3 讨论

医疗器械的污染是当前公共卫生领域的一个重要问题。它直接影响着手术质量和患者的生命安危[7]。作为污染后医疗器械的最初环节，器械预洗过程的彻底与否是有效灭菌的前提与基础。研究表明，由器械清洗不彻底导致的污染物凝固、滋生细菌并形成的顽固性生物膜是导致灭菌失败进而发生医源性感染的主要原因[8-9]。随着手术器械的多样化、精细化以及结构复杂化，传统人工清洗方法可能很难对手术器械进行完全、彻底的清洗。本研究结果显示，经机械清洗后的手术器械无论是通过目测法、蛋白棒法测定法、隐血试纸法的合格率均明显高于人工清洗组。超声波清洗机原理由超声波发生器发出的高频振荡信号，通过超声的“空化效应”、超声波在液体中沿声的传播产生的“直进流”以及液体粒子推动产生的加速度，从而达到剥离、溶解被清洗物表面污垢的目的[10]。另外，超声清洗机还具有各批次间清洗参数设置统一的优势，可最大程地保证各批次间的清洗不存在差异。超声清洗机可以将手工清洗中难以清洗的部位清洗的更彻底，不仅清洗效率及质量高，而且还能节省人力，尤其在精细器械的清洗中更显优势。

在进行金属器械的清洁工作时，应该考虑医疗器械的污染时间，选择合理的清洁方式。器械清洗烘干后长时间暴露于空气中或未按时灭菌,可再次造成细菌污染[11]，本研究结果显示洁净金属器械在1～2 h内及时灭菌可达到100%合格的标准，而且无论采用等离子灭菌器还是压力蒸汽灭菌器，灭菌效果均无统计学差异。洁净金属器械在3 h内采取上述2种消毒方式时，会出现不同程度的污染情况，差异无统计学意义。但洁净金属器械在4 h后再进行消毒时，压力蒸汽灭菌器灭菌效果显著优于等离子灭菌器。因此，为保证金属器械灭菌的有效性，应尽量在2 h内进行灭菌，若超出2 h建议金属器械重新进行清洗。

虽然采取不同的灭菌方式2 h内可达到灭菌的效果，但金属器械在使用的过程中，灭菌后器械存放时间也是影响灭菌有效性的因素，崔海丽等[12]研究显示无菌物品的有效期与时间因素有关，存放于消毒供应中心的无菌物品6个月仍然无菌生长。ATP作为细胞内的能量物质，普遍存在于微生物等细胞内，它在镁离子和氧气存在的条件下催化荧光素酶氧化脱羧，产生氧化荧光素并释放出光子，产生560 nm的荧光[13-14]，因此可用ATP荧光强度的方法检测灭菌合格率，本研究结果显示，枯草杆菌污染后经等离子灭菌器及压力蒸汽灭菌器消毒的金属器械可分别放置6个月及8个月，但压力蒸汽灭菌器灭菌消毒的金属器械消毒放置8个月后，ATP荧光检测的合格率为97%，提示压力蒸汽灭菌器灭菌消毒8个月后可能存在枯草杆菌以外的其它细菌污染。

通过本研究结果提示清洁后的金属器械采用不同的灭菌方式2 h内均可达到灭菌的效果，但超过4 h再进行消毒时，压力蒸汽灭菌器灭菌效果显著优于等离子灭菌器灭菌。虽然灭菌方式不同，但灭菌合格后6个月为2种灭菌方式有效期，超过该时间后建议重新灭菌处理。