子宫内膜癌中VM、Leptin、VEGF的表达及与临床特征的关系

李美艳， 韩新彦， 王菊荣， 呼君瑜， 陈永学， 张易欣， 宋春丽， 卢 静， 牛广旭

(邯郸市中心医院1妇一科， 2麻醉科， 3生殖医学科， 4病理科， 河北 邯郸 056008)

子宫内膜癌(endometrial carcinoma，EC)是最常见的妇科恶性肿瘤之一[1]，血管生成在肿瘤的发展、凋亡等过程中发挥着重要作用[2]。血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)是一种全新肿瘤血管结构，VM被证实在多种恶性肿瘤中存在[3-4]。肥胖作为子宫内膜癌的“三联征”之一，与EC发生密切相关，瘦素(Leptin)作为重要的脂肪因子扮演着重要的角色[1]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可促进内皮细胞的活化与迁移，是一种重要的促血管生成蛋白[5]。VM、Leptin、VEGF均与EC等肿瘤的侵袭性密切相关[2,6]。了解三者与EC之间的关系，有助于更好地了解EC的发病机制，也为其治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1临床资料选取邯郸市中心医院诊治患者共345例为研究对象：经病理检查为EC并进行了手术治疗的患者197例(EC组)，不典型增生患者85例(不典型增生组)，正常子宫内膜患者63例(正常子宫内膜组)。EC患者年龄24～72岁，平均年龄(50.19±0.68)岁。≥50岁104例，<50岁93例。根据国际妇产科联盟(FIGO 2009)手术-病理分期标准：Ⅰ～Ⅱ期170例，Ⅲ～Ⅳ期27例；组织学分化：高、中分化144例，低分化53例；肌层浸润深度：≥1/2肌层51例，<1/2肌层146例；组织学类型：Ⅰ型155例，Ⅱ型42例。术后证实有淋巴结转移25例，无转移172例。实验标本均来自于诊刮及手术切除子宫的内膜标本，排除有心、脑、肾重要器官功能障碍、凝血系统障碍、出血疾病者，就诊前均未行放射、化疗治疗，EC患者均为初次手术且肿瘤均为原发。

1.2实验方法采用CD34-PAS双重染色法，检测各内膜组织中VM的表达；免疫组织化学SP法检测Leptin和VEGF蛋白的表达情况。PAS染色试剂盒购自美国Sigma公司，大鼠抗小鼠CD34抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗体Leptin多克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司，鼠抗人VEGF单克隆抗体、免疫组织化学SP试剂盒、PBS缓冲液、DAB试剂盒均购自福州迈新生物技术公司，各实验步骤均严格按相应试剂的说明书进行操作。CD34-PAS双染色步骤参照文献[7]，免疫组化SP法步骤参照文献[8]。

1.3结果判定存在VM 结构的判定标准：由CD34染色结果阴性的肿瘤细胞构成管腔样结构，PAS阳性物质(紫红色)衬附其周围，且未见CD34阳性的内皮细胞，部分管腔内可见红细胞，即VM结构阳性标志为CD34-/PAS+[9]。免疫组化SP法判定评分标准：Leptin蛋白阳性细胞染色为细胞质中出现棕黄色或黄色颗粒；VEGF蛋白阳性染色大多数定位于癌细胞胞浆或胞膜中，阳性着色呈淡黄色至棕黄色颗粒。

1.4统计学处理采用统计软件IBM SPSS StatisticsVersion 19.0对数据进行分析处理，计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验，用Pearson法和连续校正公式来计算。采用列联系数进行VM、Leptin、VEGF三者之间的相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1免疫组化SP法染色结果CD34-PAS双重染色：VM阳性78例，阴性119例；Leptin阳性155例，阴性42例；VEGF阳性134例，阴性63例(图1～3)。

2.23组VM、Leptin、VEGF表达情况比较EC组VM结构和Leptin、VEGF蛋白的阳性表达率较不典型增生组、正常子宫内膜组差异均有统计学意义(χ2=60.668，P<0.05；χ2=105.873，P<0.05；χ2=98.976，P<0.05)，具体结果见表1。

图1 VM在子宫内膜癌中CD34-PAS双重染色(×400)

表1 3组VM、Leptin、VEGF表达情况比较/例

注：*表示χ2=60.668，P=0.000;#表示χ2=105.873，P=0.000;△表示χ2=98.976，P=0.000。

2.3VM、Leptin、VEGF与EC临床病理特征的关系VM结构和Leptin、VEGF蛋白表达均与手术-病理分期、组织学分化有关(P均<0.05)，另外，VM和Leptin表达还与淋巴结转移有关(P均<0.05)，而在年龄、肌层浸润深度、组织学类型中差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 VM、Leptin、VEGF与EC临床病理特征的关系

注：EC为子宫内膜癌；VM为血管生成拟态；Leptin为瘦素；VEGF为血管内皮生长因子。

2.4VM、Leptin和VEGF在EC中的相关关系VM、Leptin、VEGF蛋白三者在EC中表达情况进行相关性分析，结果显示三者均呈正相关关系，表明三者在EC的发生、发展中具有明显的正向协同效应(r均为正数；P均<0.05)，结果见表3～5。

表3 VM表达和VEGF蛋白的关系

注：列联系数：r=0.286,P=0.001。

表4 Leptin和VEGF蛋白表达的关系

注：列联系数：r=0.649,P=0.000。

注：列联系数：r=0.435,P=0.000。

3 讨论

3.1VM结构与肿瘤经典观点认为只有内皮细胞才能形成血管，但VM作为除血管外供应肿瘤生长的重要结构[10]，在多种肿瘤的进展、转移中均发挥着重要作用[11]。VM不依赖于血管内皮细胞，这一肿瘤内管状网络模式，可能为抗肿瘤血管治疗提供新的思路[12]。

本研究显示，197例EC组织中，VM结构阳性(VM+)78例(39.59%)，VM阴性(VM-)119例(60.41%)，EC组织中有78例存在符合标准的通道结构，而在不典型增生子宫内膜和正常子宫内膜中分别仅为4.71%和1.59%，说明EC中存在VM现象，EC组VM存在的概率显著增高，在EC组较其他组差异有统计学意义(P<0.05)。EC组织中VM的形成与患者的年龄、肌层浸润深度及组织学类型均无关，而与EC手术-病理分期、组织学分化程度及淋巴结转移均密切相关，差异有统计学意义。提示，具有VM的EC恶性程度高易发生转移，随着较晚的手术-病理分期、较差的组织学分化和淋巴结转移，VM存在的概率显著增高(P<0.05)。组织学分化程度越低及恶性程度越高的EC形成VM的能力越强，越易发生转移，恶性度更高，与陈纯等[11]的研究结果相一致，提示VM可能会成为诊断EC的重要指标之一。

3.2Leptin蛋白与肿瘤Leptin是一种分泌型蛋白质，是第1个被发现的脂肪细胞分泌的激素，已证实在促进细胞增殖和血管生成等方面具有重要作用，与多种肿瘤的发生相关[13]。

本研究染色结果显示，197例EC组织中，Leptin阳性155例(78.68%)，Leptin阴性42例(21.32%)，在不典型增生子宫内膜和正常子宫内膜中分别仅为32.94%和9.52%，说明EC中Leptin蛋白表达阳性的比率显著增高，提示高Leptin表达水平可能促进EC的发生、发展，Leptin可能促进肿瘤增殖和抑制细胞凋亡，Leptin的检测可能成为临床预测EC的一个指标，有可能作为区分良恶性子宫内膜组织的标志。EC组织中Leptin的高表达与EC患者的手术-病理分期、组织学分化程度和淋巴结转移均密切相关，差异有统计学意义。提示Leptin阳性表达与EC病情进展有紧密联系，这与以往研究结果相一致，提示Leptin可能参与了EC的侵袭和迁移过程。

3.3VEGF蛋白与肿瘤本研究中VEGF蛋白表达检测结果显示，197例EC患者中VEGF表达阳性(VEGF+)134例，阴性(VEGF-)63例，在不典型增生子宫内膜和正常子宫内膜中分别仅为21.18%和4.76%，VEGF在EC组较其他组表达差异有统计学意义，提示VEGF的高表达和EC的形成发展过程密切相关。VEGF可能是通过促进内皮细胞的分化，调控血管的生成，从而促进肿瘤形成与发展[6]，预示EC组织中VEGF的高侵袭性及易转移性，与王淑贞等[2]的研究结果一致。EC组织中VEGF的高表达与EC患者的手术-病理分期、组织学分化程度均密切相关，差异有统计学意义。说明VEGF阳性表达会随着EC的临床分期增加而增高，会随肿瘤恶性程度的增高而增强，VEGF表达与EC病情进展有着紧密的联系，可能成为判断EC预后的指标，这与王淑贞等[2]的研究结果大体一致，但组织学分化因素不太一致，这可能由于本研究病例数相对较少，有必要在以后的诊断治疗过程中收集更多的病例，展开更深入的研究。

3.4VM、Leptin和VEGF蛋白之间的相关关系刘林枝等[1]报道，Leptin参与EC的细胞增殖、血管生成、凋亡抑制等过程，Leptin发挥类似于生长因子的作用。范晓琳等[13]也指出，Leptin是血管生成的刺激因子，可通过促进血管内皮细胞的分裂增殖促进新生血管形成。国外，Misztal-Dethloff等[14]的研究表明，Leptin通过VEGF等内源性血管内皮刺激因子促进血管生成。本结果显示：VEGF阳性表达情况与VM结构阳性呈正相关，存在VM的EC中VEGF表达水平更高。Leptin与VEGF蛋白阳性表达呈正相关，VM与Leptin呈正相关，VM结构阳性、Leptin蛋白高表达、VEGF蛋白高表达的病例具有更高的临床分期和更差的组织学分化，也更易发生淋巴结转移，提示存在VM结构的EC侵袭性和转移能力更强，Leptin蛋白及VEGF蛋白能较好地诱导血管新生，与EC病情进展联系紧密，可能成为判断EC病情的指标之一。

综上所述，VM、Leptin和VEGF蛋白在EC中的表达与正常组和不典型增生组差异有统计学意义，三者表达之间正相关，在EC中的表达具有明显的正向协同效应。提示VM结构、Leptin蛋白和VEGF蛋白可能共同参与了EC肿瘤增殖，在EC的发生、发展、侵袭、转移等过程中共同起着重要作用，联合检测三者可能更有效地鉴别子宫内膜良恶性肿瘤，可能作为EC临床诊断和预测的参考指标之一。