花青素苷提取专用菊种质及适宜采收期的筛选

刘海英，高 远，邢晨涛，甄俊琦， 陆顺丽，王玉芝

(河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡 453007)

菊花(ChrysanthemumxmorifoliumRamat.)，为多年生宿根花卉，其头状花序色彩丰富，具有重要的观赏价值[1]。花青素苷(Anthocyanidin)又称花色苷，是植物体内的一种天然水溶性色素，主要存在于植物的果实、花、茎和叶中的液泡[2]，水果、蔬菜、花卉等五彩缤纷的颜色大部分都与之有关[3]。花青素苷在食品、化妆品、医药等方面有着巨大的应用前景[4-7]。菊花品种分为白色、黄色、橙色、粉色、红色、紫色和绿色七大色系[8]，其中橙色、粉色、红色和紫色4种色系菊花花色的形成均与花瓣中的花青素苷有关，尤其是紫色菊花，花瓣中花青素苷含量较高[9]。将菊花花瓣中的花青素苷进行工业化提取，对于菊花产业链的延伸具有重要的意义。

目前，我国对于菊花的研究主要在其资源的调查、花期调控及产量品质栽培学、菊花花青素苷合成关键基因表达与花色表型的关系，以及不同采收期对菊花产量和质量的研究等方面[10-14]，有关花青素苷提取专用菊种质及其适宜采收期筛选方面，目前尚未见报道。本研究选取橙色、粉色、红色和紫色4个色系、7个品种菊花为供试材料，对其不同采收期的产量和品质指标进行跟踪检测，初步明确产量较高、品质较好的品种及其适宜采收期，并进一步利用该品种开展不同采收期分批次采收试验，对初步研究结果进行验证、完善和补充，以期为鉴定和选育花青素苷提取专用菊种质及其高产优质栽培提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试品种为4个色系、7个菊花品种，包括：小菊品种橙小菊(橙色)、粉小菊(粉色)、粉色思绪(粉色)、意大利红(红色)、红五九(紫色)和大菊品种紫玉(紫色)和姹紫嫣红(紫色)(河南师范大学生命科学学院菊花圃种植)。在一般大田栽培方式管理下，5个小菊品种完全自然生长，2个大菊品种紫玉和姹紫嫣红仅保留主茎，不断除去多余的腋芽，待花蕾出现后，通过不断抹蕾，仅保留1朵顶生花蕾。

试验分为两阶段。第一阶段：选取上述7个菊花品种代表性植株各3株，标记首批进入开花状态的头状花序，随开花进程推进设置7个采收期(Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期和Ⅶ期)，在每个采收期分别等数量采收标记过的菊花头状花序。第二阶段：在第一阶段试验基础上，选择小菊品种红五九代表性植株12株，分成4组，在4个采收期分别按5个批次采收所有达到标准的菊花头状花序。采收的菊花头状花序用于产量和品质指标的测定。

小菊品种7个采收期形态特征分别为：Ⅰ期，花序最外层显色且花瓣微微张开；Ⅱ期，花序最外层舌状花花瓣展开至竖立状态；Ⅲ期，花序最外层舌状花花瓣展开至45°张角；Ⅳ期，花序最外层舌状花花瓣完全伸展，中间管状花集中部分全为黄色；Ⅴ期，花序最外层舌状花花瓣完全伸展，中间管状花区域黄色消失一半且雌蕊Y形柱头突出；Ⅵ期，花序最外层舌状花花瓣完全伸展，中间管状花区域从外向内1/2到2/3处黄色消失且雌蕊Y形柱头突出；Ⅶ期，花序最外层舌状花花瓣颜色变暗且略枯萎，中间管状区域黄色全部消失且雌蕊Y形柱头突出。大菊品种7个采收期形态特征分别为：Ⅰ期：花序从外向内第一、二轮花瓣显色且微微张开，始花期；Ⅱ期：花序从外向内第一、二轮花瓣颜色加深，体积膨大，张开角度加大，从外向内第三、四轮花瓣花序微微张开，初花期；Ⅲ期：花序从外向内第三、四轮花瓣张开角度加大，内层仍有数层花瓣未张开，盛花前期；Ⅳ期：花序最外层花瓣完全伸展，露出中间管状花集中部分且全为黄色，盛花中期；Ⅴ期：花序从外向内第一、二轮花瓣边缘略有萎蔫状态，中间管状花区域外围一、二圈黄色消失且雌蕊Y形柱头突出，盛花后期；Ⅵ期：花序从外向内第三、四轮花瓣边缘略有萎蔫状态，中间管状花区域从外向内1/2～2/3处黄色消失且雌蕊Y形柱头突出，开花后期；Ⅶ期：全花序花瓣颜色变暗且呈萎蔫状态，中间管状区域黄色全部消失且雌蕊Y形柱头突出，开花末期。

1.2 仪器与试剂

仪器：UV-2600紫外分光光度计(岛津企业管理中国有限公司)；723N可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)；FA2004 电子分析天平(上海上平仪器有限公司)；PHSJ-3F实验室pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。

试剂：盐酸(郑州派尼化学试剂厂)；无水乙醇和柠檬酸(天津市德恩化学试剂有限公司)；乙酸钠(天津兴复科技发展有限公司)；冰乙酸(天津市富宇精细化工有限公司)；氯化钾(上海振兴试剂厂)；柠檬酸钠和氢氧化钠(天津市瑞金特化学品有限公司)；双蒸水为河南师范大学生命科学学院植物生长发育调控实验室制备。所有试剂均为分析纯。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 单花序花瓣干质量的测定 采集新鲜菊花头状花序舌状花花瓣，先用湿纱布擦去表面灰尘，再用吸水纸吸干表面水分，将所有舌状花花瓣从花序上取下，在40 ℃下鼓风干燥72 h后称量花序舌状花花瓣干质量。将烘干后的舌状花花瓣收集置于避光阴凉通风处存放，用于花青素苷含量的检测。

1.3.2 花青素苷含量的测定 采用pH示差法测定[15-17]。将体积分数为80%的无水乙醇与0.1 mol/L的盐酸溶液以1∶2的体积比混合，配制成花青素苷的浸提剂。准确称取0.2 g不同品种菊花花瓣，添加10 mL花青素苷浸提剂，在室温下避光浸提24 h后滤去花瓣，滤液用于测定花青素苷含量。取1 mL样品稀释液分别加入pH值为1.0和4.5的缓冲溶液定容至10 mL，室温下平衡105 min后，以浸提液调零，于515 nm和700 nm波长下测定吸光度。根据Giusti等的研究，按公式(1)计算舌状花花瓣中花青素苷含量[18]。

X1=(ΔT×V×F×M×1000)/(ε×m)

公式(1)

式中X1：花青素苷含量(mg/g)；ΔT:吸光度值，ΔT=(A515nm-A700nm)pH1.0-(A515nm-A700nm)pH4.5；V:浸提液体积(L)；F:稀释倍数；M:矢车菊-3-O-葡萄糖苷的相对分子质量449.2；ε:摩尔消光系数26 900；m:样品质量(g)。

1.3.3 单花序花青素苷含量的计算 单花序花青素苷的含量由单花序花瓣干质量与花青素苷含量相乘求得(mg)。

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2010进行数据运算并作图；采用SPSS 11.5软件对数据进行单因素方差分析，并判断不同菊花品种间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 7个菊花品种不同采收期产量及品质的变化

2.1.1 7个菊花品种不同采收期单花序花瓣干质量的变化 由表1可知，随开花进程的推进，7个菊花品种单花序花瓣干质量逐渐增加，粉色思绪和粉小菊干质量持续增加直到Ⅶ期达到最大值，橙小菊、紫玉和姹紫嫣红干质量在Ⅴ期达到最大值后逐渐下降，意大利红和红五九干质量在Ⅵ期达到最大值后下降。小菊品种中，红五九单花序花瓣干质量在Ⅳ期、Ⅴ期和Ⅵ期较高，与粉色思绪相比其最大值略低。大菊品种由于舌状花数量多，体积大，单花序花瓣干质量及其最大值均明显高于小花品种，以紫玉较大。表明，小菊品种红五九选择在Ⅵ期采收，粉色思绪选择在Ⅶ期采收，大菊品种紫玉选择在Ⅴ期采收，可以获得较高的单花序花瓣干质量。

表1 7个菊花品种不同采收期单花序花瓣干质量的变化 mg/g

注：同列数据后不同小写和大写字母分别表示0.05和0.01水平上的差异显著，下同。

2.1.2 7个菊花品种花青素苷含量的变化 由表2可知，随开花进程的推进，7个菊花品种花青素苷含量均呈先增加再减少的趋势，粉色思绪和粉小菊最大值出现在Ⅲ期，橙小菊、红五九、紫玉和姹紫嫣红最大值出现在Ⅳ期，意大利红最大值则出现在Ⅴ期。红五九和意大利红花青素苷含量明显高于其他5个品种，在Ⅳ期和Ⅴ期均以红五九较高，其最大值在所有小花品种不同采收期中最高。表明，红五九选择在Ⅳ期采收，可以获得较高花青素苷含量。

2.1.3 7个菊花品种单花序花青素苷含量的变化 由表3可知，随开花进程的推进，粉小菊单花序花青素苷含量总体上持续增加；粉色思绪在Ⅲ期达到最大值后略有下降，Ⅴ期后又逐渐恢复，在Ⅶ期再次达到最大值；其他5个品种均呈先增加后减少的趋势，其中橙小菊和红五九在Ⅳ期达到最大值，意大利红、紫玉和姹紫嫣红则在Ⅴ期达到最大值。大菊品种单花序花青素苷含量均明显高于小花品种，其中紫玉较高，其最大值在7个品种中最高；小菊品种中以红五九最高，其次是意大利红，其他3个小菊品种均较低。表明，小菊品种红五九选择在Ⅳ期采收，大菊品种紫玉选择在Ⅴ期采收，可以获得较高的单花序花青素苷含量。

表2 7个菊花品种不同采收期花青素苷含量的变化 mg/g

表3 7个菊花品种不同采收期单花序花青素苷含量的变化 mg/g

综合2.1结果，在小菊品种中，红五九单花序花瓣干质量在Ⅳ期之后均较高，在Ⅳ期出现花青素苷含量和单花序花青素苷含量最大值，并且高于其他4个小花品种，即红五九在5个小花品种中产量最高，品质最优；与2个大花品种相比，红五九的单花序花瓣干质量和单花序花青素苷含量较低，但其花青素苷含量较高，品质更优，因此，可选择小菊品种红五九为花青素苷提取专用菊种质，其适宜采收期可初步确定为Ⅳ期。

2.2 小菊品种红五九不同采收期不同批次产量及品质的变化

2.2.1 红五九不同采收期不同批次单花序花瓣干质量的变化 由表4可知，按采收期分析批次间变化，随着采收批次的推迟，红五九单花序花瓣干质量基本呈逐渐下降的变化趋势，其中在Ⅱ期和Ⅲ期采收时，前4个批次间变化幅度较大，在Ⅳ期和Ⅴ期采收时则较平稳。按批次分析采收期间变化，随着采收期的推迟，单花序花瓣干质量逐渐增加，在Ⅳ期和Ⅴ期采收时达到最大，这2个采收期之间差异多数情况不显著(第3批次，在Ⅳ期采收略低于在Ⅴ期采收除外)。表明，在Ⅳ期和Ⅴ期采收，尤其是在前4个批次采收，有利于获得较高的红五九单花序花瓣干质量。

2.2.2 红五九不同采收期不同批次花青素苷含量的变化 由表4可知，按采收期分析批次间变化，随着采收批次的推迟，红五九花青素苷含量呈现不同的变化趋势，具体为：在Ⅱ期采收时逐渐增加；在Ⅲ期采收时变化基本平稳(第2批次比第1批次有小幅增加，第3、4批次与第1批次相近，第5批次比第1批次有小幅减少)；在Ⅳ期采收时变化平稳(11.91～12.99 mg/g)；在Ⅳ期采收时变化平稳；在Ⅴ期采收时逐渐下降。按批次分析采收期间变化，在第1批次采收时，随着采收期的推迟，花青素苷含量逐渐增加，处理间差异均达到显著或极显著水平；在第2批次采收时，在Ⅴ期采收的花青素苷含量较高；在第3批次采收时，不同采收期之间差异均不显著；在第4和第5批次采收时，则Ⅱ期最高、Ⅳ期居中、Ⅲ期和Ⅴ期最低(第4批次时，Ⅳ期和Ⅲ期之间差异不显著)。表明，Ⅴ期采收的第1和第2批次，Ⅱ期采收的第4和第5批次红五九均可以获得最高的花青素苷含量；在Ⅳ期采收红五九，不同批次样品花青素苷含量均比较高且变化稳定。

2.2.3 红五九不同采收期不同批次单花序花青素苷含量的变化 由表4可知，红五九不同采收期5个采收批次的单花序花青素苷含量与单花序花瓣干质量变化趋势和处理间差异基本一致。不同之处在于，按采收期分析批次间变化，Ⅱ期采收时，不同批次样品间变化基本平稳，有一定幅度波动；Ⅴ期采收时随采收批次推迟，单花序花青素苷含量持续下降。按批次分析采收期间变化，在第1和第2批次，Ⅳ期低于Ⅴ期，在第3批次，二者持平；在第4批次，Ⅳ期则高于Ⅴ期；在第5次批次采收时，Ⅱ期高于Ⅲ期，达到与Ⅳ期和Ⅴ期相同的水平。表明，Ⅴ期和Ⅳ期采收的前4个批次样品均可以获得较高的红五九单花序花青素苷含量，以Ⅳ期采收变化较平稳。

表4 小菊品种红五九不同采收期不同批次产量及品质的变化

3 结论与讨论

选择合适的种质，确定科学合理的采收期对于保证花青素苷提取用菊质量，提高其产量具有重要的意义。孙卫等[9]研究指出，粉色、红色和紫色菊花花瓣中花青素苷含量依次增加；Xiang等[19]研究指出，橙色菊花花青素苷含量低于红色菊花。随着植物发育进程的推进，其有效成分和产量有关指标均发生变化，这是确定最佳采收期的基本依据。刘晶等[20]在对金银花采收期的研究中指出，花蕾的早期阶段是金银花的最佳采收时期；杨俊等[21]和胡碧波等[22]的研究指出，杭白菊中的总黄酮和木犀草素-7-β-D-葡萄糖苷在开花初期均较高，也与杭白菊在生产实际中多在蕾期和开花初期采收相一致。

本研究7个菊花品种不同采收期试验结果显示，小菊品种按花青素苷含量最大值从小到大的顺序依次为：粉色思绪(粉色)< 橙小菊(橙色)<粉小菊(粉色)<意大利红(红色)<红五九(紫色)，与已有研究结果基本一致。2个紫色大菊品种的花青素苷含量峰值较低，与橙小菊相近，介于粉小菊和粉色思绪之间，这可能与其舌状花花瓣面积大，表现在舌状花花瓣干质量大，对花青素苷起到了稀释效应有关，这2个品种在Ⅴ期达到最大值时差异不显著。在花青素苷含量上，小菊品种红五九最高，尽管其单花序花青素苷含量低于大菊品种紫玉和姹紫嫣红，但是其单株平均头状花序数可达460余朵，单株总花青素苷产量远高于同等土地面积上的大菊品种的花青素苷产量，因此初步确定红五九为花青素苷提取专用菊种质。由于本试验条件所限，仅涉及7个具有代表意义的菊花种质，小菊品种红五九在丰富的菊花种质资源库中可能并不是最理想的花青素苷提取专用菊种质，但本研究为继续开展相关探索，筛选出更优秀的花青素苷提取专用菊种质提供了参考。由于红五九在Ⅳ期采收时，单花序花瓣干质量、花青素苷含量和单花序花青素苷含量均较高，因此，初步确定其适宜采收期为Ⅳ期。

上述结果是在同一植株上按开花进程逐渐取材获得的，能否确实保障原材料生产的高产和优质，答案仍不清楚，为此，本试验进一步选择红五九不同植株，分别在Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期4个采收期，分5个批次采收试验。结果显示，Ⅳ期和Ⅴ期单花序花瓣干质量均较高，采收批次越晚，单花序花瓣干质量越少；Ⅴ期采收的第1、2批次，Ⅱ期采收的第4、5批次花青素苷含量最高，但均存在大幅度的变化，Ⅳ期采收时，花青素苷含量较高且变化稳定；Ⅴ期和Ⅳ期采收的前4个批次样品均可以获得较高的红五九单花序花青素苷含量，其中Ⅴ期采收的前2个批次较高，这两个采收期的第3批次差异不显著，Ⅳ期采收的第4批次较高，所有采收期下的第5批次样品均较低，其中Ⅲ期最低。从获得品质高且在批次间稳定、产量也高的原材料角度考虑，选择在Ⅳ期采收最为理想，这有效验证了上述7个菊花品种不同采收期试验的结果。同时，本试验结果也提示另一种复合采收期采收机制可能具有潜在的优势，可设置4个采收批次，不同批次采收期不同，具体为：第1批次，Ⅴ期(对应分批采收试验Ⅴ期第1批次)；第2批次，Ⅴ期(对应分批采收试验Ⅴ期第2批次)、Ⅳ期(对应分批采收试验Ⅳ期第3批次)和Ⅱ期(对应分批采收试验Ⅱ期第5批次)；第3批次，Ⅳ期(对应分批采收试验Ⅳ期第4批次)；第4批次，Ⅳ期(对应分批采收试验Ⅳ期第5批次)。采用复合采收期采收机制可能有利于进一步提高小菊品种红五九的产量和品质，减少采收次数，对此尚需进一步试验验证。本试验结果显示，在Ⅴ期采收的前2个批次红五九产量高、品质优，在Ⅱ期采收的第5批次可以获得最高的舌状花花瓣花青素苷含量，单花序舌状花花瓣花青素苷含量与Ⅳ期和Ⅴ期采收差异不显著，如果按7个采收期设置分批次采收试验，是否会有新的发现，对此尚待进一步研究。