光质对苋菜愈伤组织生长及甜菜色素和类胡萝卜素合成的影响

张媛媛，张心雨，2，张毛毛，梁 珥，潘君飞，2，刘生财，2*

(1.福建农林大学 园艺学院，福建 福州 350002; 2.福建农林大学 园艺植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

苋菜(AmaranthustricolorL.)中富含甜菜色素、类胡萝卜素等，因其取材及色素提取较为方便，是提取和研究甜菜色素与类胡萝卜素的重要资源。光质是植物生长和发育不可缺少的环境因子，对植物的生长发育、光合作用、基因表达、次生代谢产物的合成积累有着重要的影响[1-3]。近年来，学者们围绕光质对植物愈伤组织生长及其次生代谢产物含量影响展开了多方面的研究[4-9]。Anna等[10]研究表明，红光降低了风信子愈伤组织中类胡萝卜素的含量。许莉等[11]研究发现，与白光相比，黄光、红光、蓝光均降低了叶用莴苣中类胡萝卜素的含量。目前，光质对苋菜愈伤组织中甜菜色素含量的影响还没有相关报道，为此，本试验以苋菜愈伤组织为初始材料，将其置于不同光质下培养，探究光质对苋菜愈伤组织中甜菜色素及类胡萝卜素合成的影响，旨在为产业化生产甜菜色素和类胡萝卜素提供理论依据和技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

福建农林大学园艺植物生物工程研究所诱导保存的苋菜愈伤组织。

1.2 不同光质处理苋菜愈伤组织及其形态观察

以苋菜愈伤组织为材料，选取干燥、质地松软、生长状态良好且一致的苋菜愈伤组织接种到MS基础培养基中(含2，4-D 0.5 mg/L 、6-BA 6.0 mg/L、蔗糖 30 g/L、琼脂 7 g/L，pH值5.8)继代增殖培养，培养周期30 d。增殖培养后，选取生长状态一致的苋菜愈伤组织接种在培养基中(MS+ 2，4-D 0.5 mg/L、6-BA 6.0 mg/L、蔗糖 30 g/L、琼脂 7 g/L，pH值5.8)，每瓶接种4块，每块约0.2 g，共接种180瓶。将其平均分为6组，分别置于蓝光、白光、绿光、红光、远红光、黑暗(CK)6种不同光质条件下进行培养。不同光源技术参数如表1所示。光照时长16 h/d，培养温度(25±2)℃，培养30 d，在培养的第3、7、14、21、28天时拍照、观察并记录其形态。

表1 不同光源技术参数

1.3 测定项目及方法

1.3.1 甜菜色素的提取与测定 由于绿光、红光、远红光及黑暗条件下苋菜愈伤组织表面并没有变红，所以只进行蓝光及白光处理下甜菜色素的提取及含量测定。分别称取蓝光及白光处理下的苋菜愈伤组织0.05 g，在液氮中研磨，之后迅速加入1 mL预冷甲醇，剧烈振荡混匀，置于 4 ℃条件下30 min，12 000 r/min离心10 min，去上清液。用双蒸水重悬沉淀，置于4 ℃ 条件下30 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液，用紫外分光光度计分别在538 nm和465 nm下测甜菜红素和甜菜黄素含量，二者含量之和作为甜菜色素总量。每种光质进行3次重复。

1.3.2 类胡萝卜素提取及条件优化 取苋菜愈伤组织，放在玻璃研钵中磨成粉状，准确称取0.3 g放入具塞的三角瓶中，以丙酮(分析纯级)、石油醚(分析纯级)及氯仿(分析纯级)作为浸提溶液 ，研究不同浸提溶液、配比和时间对苋菜愈伤组织中类胡萝卜素提取效果的影响，具体设计见表2。提取后的溶液用紫外分光光度计在445 nm下测定类胡萝卜素含量,以筛选得到类胡萝卜素最佳提取条件，研究6种光质对苋菜愈伤组织中类胡萝卜素含量的影响。

表2 苋菜愈伤组织中类胡萝卜素浸提溶液及浸提时间

1.4 数据处理与分析

用Excel及SPSS 19.0对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同光质对苋菜愈伤组织形态的影响

不同光质处理下，苋菜愈伤组织的生长及形态质地有明显差异。如图1所示，蓝光处理下苋菜愈伤组织产生的甜菜色素的量随着培养时间的增加而增加(图1A1、A5)，处理第28天时，蓝光处理下的苋菜愈伤组织表面红色物质产生量较多，质地较密实(图1A5)；白光处理下苋菜愈伤组织产生的甜菜色素随着培养时间的增加而增加，但产生的量少于蓝光处理(图1B1、 B5)，处理第28天时，白光处理下的苋菜愈伤组织表面产生少量的红色物质，质地松软，呈块状(图1B5)；绿光处理下苋菜愈伤组织表面没有红色物质产生(图1C2、 C5)，处理第28天时，苋菜愈伤组织表面呈现微黄色、透明块状(图1C5)；红光处理下苋菜愈伤组织表面没有红色物质产生(图1D2 、D5)，处理第28天时，苋菜愈伤组织表面呈现透明乳白色，质地松软(图1D5)；远红光处理下的苋菜愈伤组织表面没有红色物质产生(图1E2、 E5)，处理第28天时，苋菜愈伤组织表面呈现微黄色、透明块状(图1E5)；黑暗条件下苋菜愈伤组织表面没有红色物质的产生(图1F2 、F5)，处理第28天时，苋菜愈伤组织表面呈现白色疏松、半透明块状(图1F5)。相同培养时间，蓝光、白光处理下苋菜愈伤组织表面有红色物质产生，且蓝光处理下红色物质产生较多，但绿光、红光、远红光处理以及黑暗条件下的苋菜愈伤组织表面并没有红色物质产生。由此可知，蓝光对苋菜愈伤组织中甜菜色素的产生有明显促进作用。

A：蓝光、B：白光、C：绿光、D：红光、E：远红光、F：黑暗；1、2、3、4、5分别代表处理第3天、第7天、第14天、第21天、第28天 图1 不同光质对苋菜愈伤组织形态的影响

2.2 不同光质对苋菜愈伤组织中甜菜色素含量的影响

对蓝光和白光处理下苋菜愈伤组织中甜菜色素含量进行测定。通过表3可以看出，蓝光处理下苋菜愈伤组织中甜菜红素、甜菜黄素及甜菜色素总量均显著高于白光处理。蓝光处理下苋菜愈伤组织中甜菜红素、甜菜黄素和甜菜色素总量分别为(0.109 3±0.011 2)mg/g，(0.037 8±0.005 3)mg/g和(0.147 0±0.013 3)mg/g，分别是白光处理下的5.28倍、2.33倍和3.99倍。说明蓝光对苋菜愈伤组织中甜菜红素和甜菜黄素含量均有促进作用。

表3 蓝光和白光对苋菜愈伤组织中甜菜色素含量的影响 mg/g

注：同行数据后不同小写字母表示在0.05水平差异显著，下同。

2.3 苋菜愈伤组织中类胡萝卜素浸提溶液及浸提时间筛选

在筛选苋菜愈伤组织中类胡萝卜素浸提溶液时发现(表4)，单一试剂以石油醚、氯仿浸提类胡萝卜素8、6 h效果最佳，与高桂珍等[12]对油菜种子类胡萝卜素总含量测定结果一致，这可能是因为石油醚、氯仿对类胡萝卜素有破坏作用。丙酮为浸提溶液，浸提4 h，类胡萝卜素提取量为22.4 mg/kg；浸提6 h，类胡萝卜素提取量为23.6 mg/kg；浸提8 h，类胡萝卜素提取量为24.0 mg/kg。石油醚为浸提溶液，浸提4 h，类胡萝卜素提取量为28.0 mg/kg；浸提6 h，类胡萝卜素提取量为22.4 mg/kg；浸提8 h，类胡萝卜素提取量为40.8 mg/kg。氯仿为浸提溶液，浸提4 h，类胡萝卜素提取量为23.6 mg/kg；浸提6 h，类胡萝卜素提取量为38.8 mg/kg；浸提8 h，类胡萝卜素提取量为35.2 mg/kg。丙酮∶石油醚为1∶1的混合浸提溶液，浸提4 h，类胡萝卜素提取量为28.0 mg/kg；浸提6 h，类胡萝卜素提取量为25.6 mg/kg；浸提8 h，类胡萝卜素提取量为64.0 mg/kg。丙酮∶氯仿为2∶1的混合浸提溶液，浸提8 h，类胡萝卜素提取量为23.2 mg/kg。石油醚∶氯仿为1∶1的混合浸提溶液，浸提8 h，类胡萝卜素提取量为44.0 mg/kg。总体来看，类胡萝卜素的提取量随着浸提时间的增加而增高，但其稳定性较低，因此浸提时间不宜过长。对单一溶剂提取8 h的效果进行比较，类胡萝卜素提取量依次为石油醚>氯仿>丙酮。对混合浸提剂提取8 h的效果进行比较，类胡萝卜素提取量依次为丙酮+石油醚>石油醚+氯仿>丙酮+氯仿。由此可以看出，丙酮、石油醚以1∶1混合为浸提溶液，料液比1∶100(g/mL)，提取时间8 h，可使苋菜愈伤组织中类胡萝卜素达到最佳提取效果。

表4 不同浸提溶液及浸提时间对苋菜愈伤组织中类胡萝卜素的提取效果

2.4 不同光质对苋菜愈伤组织中类胡萝卜素含量的影响

从表5可以看出，蓝光处理下苋菜愈伤组织中类胡萝卜素含量为(0.218 1±0.008 2)mg/g，白光处理下苋菜愈伤组织中类胡萝卜素含量为(0.145 9±0.007 0)mg/g，绿光处理下苋菜愈伤组织中类胡萝卜素含量为(0.053 33±0.001 3)mg/g，红光处理下苋菜愈伤组织中类胡萝卜素含量为(0.030 8±0.000 6)mg/g，远红光处理下苋菜愈伤组织中类胡萝卜素含量为(0.046 9±0.001 6)mg/g，黑暗处理下苋菜愈伤组织中类胡萝卜素含量为(0.027 2±0.001 2) mg/g。不同光质对苋菜愈伤组织中类胡萝卜素含量的影响依次为蓝光>白光>绿光>远红光>红光>黑暗，蓝光对苋菜愈伤组织中类胡萝卜素的含量有明显的促进作用。

表5 不同光质对苋菜愈伤组织中类胡萝卜素含量的影响 mg/g

3 结论与讨论

3.1 不同光质对苋菜愈伤组织中甜菜色素和类胡萝卜素合成的影响

光质是影响植物愈伤组织次生代谢产物合成的重要环境因素之一，并且不同光质对其影响存在差异。本研究结果显示，以黑暗为CK，蓝光、白光对苋菜愈伤组织中甜菜色素含量的影响程度最大，且影响程度依次为蓝光>白光。黄欢等[13]对盐地碱蓬研究发现，黑暗诱导幼苗中甜菜色素的积累，而光照则抑制了其积累；然而在愈伤组织中的影响则相反，光照促进了甜菜色素的积累，不同光质对盐地碱蓬甜菜色素诱导作用不同，白光的诱导效果最好，蓝光次之。甜菜色素的稳定性受酸碱度、光、热等因素的影响，一般以甜菜色素葡糖苷的形式存在，当pH 值为2.5～7.0时比较稳定，当pH值<2.0或pH值>9.0时甜菜红素降解，碱性条件下转变为黄色的甜菜黄素；温度愈高，甜菜色素的稳定性愈差，易产生色变，而低温(低于10 ℃)条件下稳定性较好；光质的变化可以导致甜菜色素化学结构发生变化或者加速其氧化过程，从而加快色变的速度[14]。试验中绿光、红光、远红光、黑暗下的苋菜愈伤组织表面没有红色物质产生，这可能与pH值、温度以及光照的影响有关，需进一步研究。

吴铄溟等[15]研究表明，白光和蓝光照射培养下的蛹虫草菌丝体的类胡萝卜素含量显著高于红光和黄光条件下，黑暗条件下没有检测到类胡萝卜素的生成。本研究结果显示，不同光质对苋菜愈伤组织中类胡萝卜素含量的影响程度依次为蓝光>白光>绿光>远红光>红光，此结果与前人对风信子、莴苣的研究结果不一致[10-11]。针对不一致的结论分析认为，不同植物的感光能力不同，不同光质触发不同光受体，进而影响植物的光合特性、生长发育、抗逆、衰老及次生代谢产物合成等。

3.2 类胡萝卜素提取条件的优化及效果

植物中类胡萝卜素一般均能溶于丙酮和石油醚，单一溶剂中石油醚的溶解性高于丙酮和氯仿，溶剂混合使用比单一使用提取效果好。丙酮与石油醚以1∶1混合为提取液，料液比1∶100(g/mL)，提取时间8 h，可使苋菜愈伤组织中类胡萝卜素达到最佳提取效果。学者们围绕类胡萝卜素的提取条件展开了大量研究[16-19]，其中，杨姗等[16]通过试验得出柑橘皮中类胡萝卜素的最佳提取条件为乙醇∶乙酸乙酯∶正己烷3∶1∶1混合，温度40 ℃，提取时间50 min，料液比为1∶10 (g/mL)。袁旭红等[17]利用复合酶法提取沙棘类胡萝卜素，最佳提取条件为纤维素酶∶果胶酶2∶1、酶解温度30 ℃、酶解时间25 min、酶加入量0.20%、酶解pH值7，提取率为89.99%。李世红等[18]研究认为，利用无水乙醇作为提取液，料液比1∶60(g/mL)、提取时间180 min、提取温度55 ℃，可使西兰花中类胡萝卜素达到最佳提取效果。

3.3 结论

蓝光和白光可以诱导苋菜分化出红色愈伤组织，而其他光质诱导的愈伤组织呈黄色或白色；与黑暗相比，蓝光最有利于苋菜愈伤组织中甜菜色素、类胡萝卜素的合成，白光次之，其他光质无法合成甜菜红素；苋菜愈伤组织中类胡萝卜素最佳提取条件是采用丙酮与石油醚比为1∶1混合提取溶液，苋菜愈伤组织与提取液比为1∶100(g/mL)，提取时间8 h。