人诱导多潜能干细胞在体外分化成小胶质细胞的研究进展

高艳 ，张文静 ，邓文斌, ，赵保明 *

（1湖北文理学院医学院形态学部， 2湖北文理学院医学院分子医学中心，襄阳 441053; 3美国加州大学戴维斯分校生物化学与分子医药学部，加州萨克拉门托 95817）

小胶质细胞是位于脑的巨噬细胞，为神经元提供稳定内环境，包括在脑发育期间修剪无功能的突触、清除死细胞和错误折叠的蛋白质及其它细胞碎片[1]。小胶质细胞能被炎症刺激激活，产生一系列细胞因子，包括具有潜在破坏性的肿瘤坏死因子α（TNFα），这种反应可能导致一个慢性损伤周期的激活和神经元损伤。许多与阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、运动神经元疾病/肌萎缩性侧索硬化（MND / ALS）和额颞叶痴呆（FTD）等疾病相关的基因，如TREM2、CD33、LRRK2和C9orf72[2-4]在小胶质细胞中有表达，使人们对小胶质细胞生物学特性与神经退行性疾病的相关性研究日益重视[5]。

由于被转化的小胶质细胞样细胞系具有高度增殖能力，并不适合建立非增殖、分化细胞类型的模型，因此急需一种真实可靠的人类小胶质细胞模型，而多潜能干细胞是由成人体细胞诱导或胚胎来的可无限自我更新、具有正常核型并能够被诱导分化为最终细胞类型，它们也可来自于病人（保留病人的遗传背景），并且可以用于基因编辑、质询感兴趣的基因，是很好的研究资源。然而，直到最近两年才有人使用人多能干细胞在体外重复小胶质细胞的发育过程，分化出小胶质细胞样细胞。

1 小胶质细胞的发育起源

在小鼠胚胎第7.5天（E7.5）和E8.25中，卵黄囊血岛中产生两波胚胎巨噬细胞，第一波迁移到发展中大脑并分化为小胶质细胞[6-8]，这些卵黄囊来源的巨噬细胞不依赖Myb但依赖于PU.1和Irf8[9,10]。另外一波造血干细胞（HSCs）来自于E10.5的主动脉-性腺-中肾区，构成胎肝和骨髓，其中来自骨髓龛中HSCs分化为成年血细胞，其更新依赖于Myb的表达。因此，依赖Myb与否可区别卵黄囊源性巨噬细胞与成熟的、确定的、血液单核细胞衍生的巨噬细胞。小胶质细胞在发展中的大脑局部增生率低，通常不会被其它脑外巨噬细胞和单核细胞所取代，而大多数在其它组织居住的巨噬细胞与之相反（最初由卵黄囊衍生的巨噬细胞，但是部分或完全被胎肝或血液单核细胞衍生的巨噬细胞替代）[11-16]。在发育过程中巨噬细胞集落刺激因子1（CSF1）对骨髓细胞增殖、分化和维持其活性起重要作用。在脑中，一种选择性CSF1受体的配体—白细胞介素-34（IL-34）能支持小胶质细胞存活、分化、分支形态和持续成熟[17]。

虽然人小胶质细胞的发育研究受限，但是它的发育过程与小鼠的类似。卵黄囊源巨噬细胞出现在E17[18]，E31后进入大脑[19,20]，并且与神经元一起成熟成为功能完全的分支状的小胶质细胞，于妊娠第20周皮质神经元开始显示自发电活动[21]。

2 诱导 hiPSCs分化产生小胶质细胞（hiPSC-MG）

2.1 卵黄囊来源的造血干细胞是hiPSCs分化成hiPSC-MG的关键

在胚胎发育早期，原始造血祖细胞生成于卵黄囊的血岛[22,23]，小胶质细胞来自于卵黄囊造血祖细胞但不同于胚胎来源的外周骨髓细胞[15]，这导致难以区分小胶质细胞和外周来源的巨噬细胞。最近有研究证明，卵黄囊来源巨噬细胞的前体细胞不依赖MYB转录因子，而依赖RUNX1-和PU1[24,25]。为了从hiPSCs产生小胶质细胞，只有先分化出HPCs才能得到反映体内真实状态的小胶质细胞。尽管具有不同的分化效率和挑战，许多有基质细胞饲养层和无基质细胞饲养层的实验方法都可以从hiPSCs生成HPCs[26-30]。进一步研究发现HPCs大量表达CD235a，其表达受控于激活activin A/Nodal通路并同时抑制WNT/β-catenin信号。因此，在合适的培养条件下如小鼠OP9基质饲养层[31]、限定培养液（BMP4、VEGF、SCF、IL-3、M-CSF 等）[32]或者低氧条件（5% O2）[33]，hiPSCs可诱导出Flk-1+和CD235a+HPCs，继续在体外培养皿中诱导分化可产生小胶质细胞样细胞。

2.2 使用人诱导多能干细胞分化成小胶质样细胞(hiPSC-MG)

人体来源的小胶质细胞有利于探索其在健康和疾病中的作用，然而与中枢系统其他类型细胞相比，培养出人多能干细胞分化的真实可靠的小胶质细胞还处于探索阶段。直到近两年才有人使用多能干细胞诱导分化产生小胶质细胞样的吞噬细胞，并且提供了具体的分化步骤、功能检测和基因组分析对其进行鉴定[31,33-35]（表1）。

Muffat等从hESCs和hiPSCs产生小胶质样细胞[34]，将其命名为多能干细胞来源的小胶质细胞样细胞（pluripotent stem cell-derived microglia-like cells，pMGLs）。他们使用与脑脊液相似的无血清神经-胶质培养基可以培养多种类型神经和胶质细胞。为了选择性培养小胶质细胞，他们使用改良的聚苯乙烯培养板，可以使鼠新生小胶质细胞和人胎小胶质细胞粘附，而神经祖细胞来源的神经胶质衍生物粘附较差。随后使用IL-34和CSF1促进小胶质细胞的分化产生pMGLs。该方法中先将iPSCs在基质饲养层上培养形成胚体（EBs），EBs包含中胚层细胞系和发展的神经外胚层细胞，它们同时出现在其培养系统里。因此，该系统中其他类型的细胞提供了所有内源分子，例如，神经元和胶质细胞能够产生M-CSF、IL-34、CD200、CX3CL1和TGFβ等。此外他们的方法中为了筛选粘附的单个前体细胞，使用表面处理的聚苯乙烯的培养板（Primaria 6-well plate），但是也可能粘附其它类型细胞，如粘附的神经外胚层源的星形胶质细胞，星形胶质细胞可产生骨髓细胞/小胶质细胞所需的所有细胞因子。另外，粘附选择这一步骤包含了持续暴露EBs粘附细胞达一个月，因此增加暴露那些粘附的骨髓细胞分化成中枢和中胚层条件培养基的可能性。值得注意的是，他们没有添加转化生长因子β1（Transforming growth factor β1，TGFβ-1）到培养基里，尽管有证据证实TGFβ-1可影响小胶质细胞在体或离体产生和建立小胶质细胞的信号[5]。验证产生的pMGLs，将pMGLs与3D神经元共培养，并且用代表性的图像和视频记录和显示pMGLs的延伸投影，由此显示其分支进程。Muffat等的实验步骤试图重复小胶质细胞个体发生，通过使用卵黄囊样EBs来产生它们的小胶质细胞。这一进展强调了可以在体外产生人类小胶质样细胞。

表1多潜能干细胞源小胶质细胞样细胞（hiPSCs-MG）培养Tab. 1 hiPSC-derived microglia culture

Pandya及其同事使用限定的培养基和星形胶质细胞共培养将hiPSCs分化成小胶质细胞样细胞。该方案分两步进行：第一步，将iPSCs诱导分化为HPC，使它们失去干细胞标记Nanog和Tr-1-81而获得CD34和CD43表达；第二步将诱导多能干细胞来源的HPC和星形细胞层共培养，同时还在培养液中添加GM-CSF、M-CSF和IL-3等细胞因子，使它们不表达CD34和CD43而表达CD11b和Iba1。该方案中第一步OP9饲养层或化学限定的方案产生HPC，继而产生人诱导多能干细胞源小胶质细胞（hiPSC-MG）。无论基质饲养层源的还是无饲养层源的HPC都不完全具有小胶质细胞特征，而在于使用G-CSF、GM-CSF和FLT3L等细胞因子进行诱导分化。这些细胞因子产生于骨髓发生中，参与产生一般的骨髓祖细胞（CMPs）分化[26,30,36-39]。该方案第二步中将诱导多能干细胞来源的造血祖细胞（iPSHPC）和星形胶质细胞一起培育在含有M-CSF的无血清的培养液里面。iPSC-MG的功能分析主要使用流式细胞仪分选（FACS）出表达CD39的 hiPSC-MG（CD39最近被报告出现在小胶质细胞）[40]，从而将hiPSC-MG从星形胶质细胞共培养体系中分离出来，仅得到约8%CD39阳性细胞。分离出来的hiPSC-MG可变为阿米巴样细胞，可内化pHrodo-red结合的大肠杆菌颗粒，通过免疫荧光图像对大肠杆菌反应产生的ROS进行评估。Pandya等使用微阵列评估hiPSC-MG RNA表达，比较hiPSC-MG、巨噬细胞、树突细胞、iPSCs和购买的胎小胶质细胞的特性。他们将鼠hiPSC-MG和胶质母细胞瘤细胞共同移植到免疫缺陷小鼠脑中发现，小鼠CX3CR1-GFP hiPSC-MG迁移到胶质细胞瘤细胞。免疫荧光分析显示，移植到小鼠脑中的hiPSC-MG类似阿米巴的形态。有趣的是，注射新生小鼠源小胶质细胞或hiPSC-MG和皮下注射树突状细胞都可显著提高胶质母细胞瘤小鼠的存活率。由于移植研究只集中在胶质母细胞瘤细胞存在的地区，而人类或小鼠的hiPSC-MG能否参与构成免疫缺陷小鼠的大脑和表现出小胶质细胞样分支形态并未提及。小鼠或人类2D或3D培养成像分析可以进一步研究hiPSC-MG对CNS环境的反应。2D研究是非常可行的，因为他们的方案已经使用了星形胶质细胞共同培养方案；小鼠3D培养研究亦是可行的研究，因为小鼠中枢神经系统织易于分离和培养，他们使用小鼠CX3CR1-GFP hiPSC-MG可在小鼠3D培养物中辨别hiPSC-MG和内源性小胶质细胞。

Muffat和Pandya的培养方案依赖于先将iPSCs形成不可控的EBs或者依赖共培养，得到有限的纯化细胞。他们试图从干细胞得到小胶质细胞及它们的造血前体细胞，但是他们的培养方法更适合骨髓样分化。这种缺陷可能导致难以区分与小胶质细胞相似的外周来的巨噬细胞。这两项研究在生产iPSCs来源的小胶质细胞方面都有局限性，他们的细胞进行了功能和转录组学分析，但是这两种方案低产量限制了使用更多功能测定定量评估小胶质细胞的能力。为了有效研究健康和疾病中的小胶质细胞功能，hiPSCs尽可能大量衍生小胶质细胞样的hiPSC-MG是必要的。

Abud等人使用来自hiPSC的完全限定的小胶质细胞分化方法，只需两步且不与星型胶质细胞共培养，得到hiPSC分化的小胶质细胞样细胞（iMGLs）。他们认为一个关键的先决条件是iPSCs向HPCs有效分化，该过程重复了小胶质细胞发育过程， HPCs代表来源于卵黄囊的原始造血细胞最终可分化成小胶质细胞。第一步，他们使用限定培养基和造血分化因子在5% O2（4d）和20% O2（6d）环境下10d后将iPSCs分化成CD43+/CD235a+/CD41+HPCs[39]。第二步，将HPCs在无血清含CSF-1、IL-34和TGFβ1的培养液中分化，分化第14d细胞表达转录因子PU.1和小胶质细胞富有的蛋白TREM2，证实了早期向小胶质细胞分化的命运保证。至38d iMGLs类似人类小胶质细胞但不是单核细胞或巨噬细胞，表达了小胶质细胞富有的其他蛋白MERTK、ITGB5、CX3CR1、TGFBR1和PROS1。像啮齿类小胶质细胞的发展，iMGLs体外的生长表达PU.1、TREM2和 CD11bint/CD45low。当iMGLs体外成熟后变成与在体小胶质细胞类似的多分支形态。为了验证分化的iMGLs，移植iMGLs到小鼠大脑研究细胞形态功能，使用RNA序列的全转录组分析和多种定量功能测定包括：比较性吞噬作用测定、迁移测定、钙成像研究等。证实这个实验步骤分化的iHPCs和iMGLs都非常像它们的体内对应物。该分化方法需要低氧浓度的培养环境，要进行几次细胞重排、多种不同的细胞因子鸡尾酒和流式细胞仪分选造血祖细胞，步骤相对比较繁琐。

Haenseler等人首选建立了直接、高效、无血清和饲养层的方法将hiPSC诱导成HPSC[41]，并且已经证明这种方法培养的是不依赖MYB转录因子，依赖RUNX1和PU.1的iHPSC，具有卵黄囊来源巨噬细胞的特征[24]。然后将HPSC与诱导多能干细胞来源的皮质神经元共培养，共培养可以保持神经成熟和功能几周，共培养产生的小胶质细胞表达小胶质细胞特有的标记物和神经退化疾病相关的基因，并且具有高度动态的分支和吞噬功能[42]。他们发现共培养的小胶质细胞下调了病理反应通路，上调了自稳功能通路，与单核细胞相比增加了促炎和促重构的细胞因子反应，证实了共培养是更好的真正的小胶质细胞生理模型。

Douvaras使用限定的化学培养基在30d内将人胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（hiPSCs）分化产生表达CD14 / CX3CR1的小胶质细胞祖细胞。小胶质细胞祖细胞的进一步分化产生动态分支小胶质细胞，表达典型的小胶质细胞标记物。 基因表达和细胞因子释放分析显示hiPSC衍生的（hiPSC-MG）与人原代小胶质细胞之间有紧密相似性，以及与巨噬细胞的区别明显。hiPSC-MG具有吞噬和响应ADP刺激产生细胞内Ca2+瞬变的功能，而巨噬细胞缺乏这种反应。为了确保方案的稳健性和可重复性，他们测试了来自不同疾病状态、年龄和性别的个体共16个hiPSC系，并使用不同的重编程策略(如mRNA/microRNA, Sendai virus)，获得来自所有细胞系的小胶质细胞祖细胞，每一个未分化hiPSC的平均产量为2～3个祖细胞，该分化方案在16种多潜能干细胞系中是高度可重复的。并且证实祖细胞的产量与整个系统不相关，与特定疾病，重编程方法或供体的性别和年龄无关。由此方法产生的小胶质细胞表达典型的标记物，呈高度动态分支，与人类原代小胶质细胞有相近的吞噬效率。

总之，以上这些研究都从iPSCs得到了与人小胶质细胞外形、功能及基因型类似的小胶质细胞，为研究与小胶质细胞相关的中枢疾病提供了很好的资源和模型。

3 hiPSC-MG应用的展望

小胶质细胞在大脑发育中起关键作用，如突触的传导和可塑性、神经发生和神经元生长[43]等。小胶质细胞介导的炎症可损害大脑功能和结构，也有很多证据表明小胶质细胞激活对神经退行性疾病有利，如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和肾上腺脑白质营养不良（ALD）[44,45]。 在ALD中，来自自体骨髓移植的吞噬细胞很可能通过替代突变小胶质细胞来发挥它们的有益效果，因为它们阻止末端神经炎症和脱髓鞘作用[46]。此外，其他大脑功能障碍包括抑郁症[47]，精神分裂症和自闭症已被认为涉及小胶质细胞功能障碍。

小胶质细胞表达的基因突变被证实与多种人类疾病发病机制有关，人类小胶质细胞疾病相关基因修饰或敲除的小鼠实验模型已经证明小胶质细胞在脑和脊髓各种疾病的发病机制方面发挥了重要作用。然而由于正常和疾病特异的人类来源小胶质细胞短缺，阻碍了进一步实验室研究和临床转化。克服这一障碍的一种解决方案是使用正常和疾病特异的hiPSCs-MG进行疾病建模、药物发现和研究及毒性筛选试验。

这些研究结果突出了来源于患者的细胞可成为再生资源的潜力，可研究人类小胶质细胞在体内的功能,探讨神经退行性疾病受到遗传学和特定突变的遗传影响，并将允许鉴定潜在的新型小胶质细胞转化疗法。虽然hiPSC-MG的验证提出了小胶质细胞在发育、健康和疾病等方面有关的一些新的问题，但是这种新的可再生资源将允许这些问题进一步得到解决。