乳腺冷冻切片的优化

王玉环，杨荣水， 方庆全*

（1厦门大学附属第一医院病理科，厦门 361003；2厦门大学附属中山医院核医学科，厦门 361004）

近年来，乳腺病变尤其是乳腺癌的发病率明显升高［1］，虽然乳腺疾病的检查方法很多，但病理组织学诊断具有重要作用［2］。目前，术中乳腺病变冷冻切片诊断依然是制定手术方案的重要依据。冷冻制片技术是快速病理诊断的基石，如何在有限的时间内又快又好地完成制片，不仅是病理诊断的需要，更是术中医师的迫切要求[3]。乳腺组织冷冻制片技术受多种因素的影响，常制片质量不稳定，易导致病理诊断困难，一定程度上影响乳腺外科术中手术方案的制定。为此，作者通过实验，从取材大小、速冻方法、切片厚度等方面探讨乳腺冷冻切片的优化方案，以期提高乳腺冷冻切片质量，为乳腺外科术中确定手术范围、缩短手术创面的暴露时间奠定基础。

资料与方法

1 一般资料

收集2017年1月至2017年12月厦门大学附属第一医院病理科的乳腺冷冻切片标本，患者均为女性，年龄18～71岁，中位年龄48岁。

2 主要设备

LEICA CM1950冷冻切片机（德国莱卡）；PHILIPS HP8203吹风机（飞利浦公司）。

3 试剂

包埋剂，AAF液（由95%乙醇A：乙酸A：甲醛F = 85：5∶10组成）， Harri苏木素染液，1%盐酸乙醇液，0.5%酸化伊红，75%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，无水乙醇，二甲苯。

4 制作“带垫”的托头

取若干个冷冻切片机配套托头，加上 0.2cm～0.3cm 厚的包埋剂后，置于冷冻切片机冻台上速冻，包埋剂冻上后，用冷冻切片机将托头上的包埋剂修平并修至余下约0.1cm厚，形成带包埋剂垫的托头，置于预先冷冻至-25℃的冻台上备用。

5 冷冻切片的制备

不同取材大小条件下乳腺冷冻切片的制备：术中新鲜乳腺标本核对无误后，书页状切开，在保证病理术中冷冻切片的取材工作后，避开坏死组织与脂肪组织，找到范围较大、肉眼观质地一致、带有乳腺病变的乳腺组织，每份标本在肉眼观质地一致的区域内取9块组织，取材大小分别为2cm×1.5cm×0.1cm（A组）、2cm×1.5cm×0.2cm（B组 ）、2cm×1.5cm×0.3cm（C组 ）、2cm×1.5cm×0.4cm（D组）、2cm×1.5cm×0.5cm（E组 ）、1cm×1cm×0.2cm（F组 ）、1.5cm×1.5cm×0.2cm（G组）、2cm×2cm×0.2cm（H组）、2.5cm×2cm×0.2cm（I组），取出预先制作的“带垫”托头，将组织块放于托头的包埋剂上，再加适量的包埋剂，将托头连同组织放置于已预先冷冻至-25℃的冻台上速冻，待乳腺组织与包埋剂刚刚冻上时，用冷冻切片机切取厚度为6μm的冷冻切片，立即放入AAF液固定30s，取出切片水洗2s，放入已预热至45℃的苏木素染色30s，取出切片水洗5s，1%盐酸乙醇液分化 1～2s，温水返蓝2～5s，0.5% 酸化伊红染 1～2s，取出切片水洗 2～5s后，依次入75%、85%、95%、无水乙醇各2s，再分别入二甲苯I、二甲苯Ⅱ各 2～5s，中性树胶封固，显微镜观察。收集30例乳腺冷冻切片标本，统计分析不同取材大小条件下乳腺冷冻切片速冻的时间，及切片质量中的切片完整、无皱褶、无冰晶3项指标的得分情况。

不同速冻方法下乳腺冷冻切片的制备：每份标本按B组的取材方法，切取5块大小为2cm×1.5cm×0.2cm的乳腺组织，随机取其中1块组织，按B组的方法进行速冻（J组）；再随机取其中1块组织，立即放置于已预先冷冻至-25℃、未预先制作 0.1ml 厚包埋剂垫的托头上，加适量的包埋剂，置于-25℃的冷冻切片机冻台上速冻（K组）；再随机取其中1块组织，立即放置于常温的托头上，加适量的包埋剂后，置于-25℃的冷冻切片机冻台上速冻（L组）；再随机取其中1块组织，室温放置30S后，放置于常温的托头上，加适量的包埋剂后，置于-25℃的冷冻切片机冻台上速冻（M组）；剩余的1块组织于室温放置60s后，余操作同B组进行速冻（N组）。以上5组其余操作同B组。收集30例乳腺冷冻切片标本，统计分析 J、K、L、M、N组5种不同速冻方法下乳腺冷冻切片速冻的时间、组织块从托头上崩裂下来的几率、无冰晶指标的得分情况。

不同切片厚度下乳腺冷冻切片的制备：按B组方法进行取材、速冻，然后用冷冻切片机连续切取6张冷冻切片，厚度分别为3μm（O组）、4μm（P组）、5μm（Q组）、6μm（R组）、7μm（S组）、8μm（T组），均立即放入AAF液固定30s，余操作同B组。收集30例乳腺冷冻切片标本，统计分析O、P、Q、R、S、T 组6种不同切片厚度下乳腺冷冻切片的切片完整、厚度均匀适中、无皱褶3项指标的得分情况。

6 冷冻切片质量观察指标

切片完整（包括无脱片、无裂隙）、厚度均匀适中、无皱褶、无冰晶各10分。结果采用±s 表示。2名高级质控师进行双盲评片，每项指标的数据为评分的均值。

7 统计学分析

采用SPSS18.0软件对冷冻切片切片质量各项指标的均数进行比较，采用方差分析组间差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 取材大小对乳腺冷冻切片的影响

A、B、C、D、E、F、G、H、I 9组乳腺组织完成速冻的时间分别为52.7±4.4s、65.3±7.8s、84.6±11.3s、122.7±15.6s、178.6±26.5s、 58.4±5.8s、61.1±4.7s、73.8±9.6s、85.3±8.2s；该 9 组切片质量评分结果见表1。由表1可见，组织厚度＜0.2cm的A组切片完整指标得分显著低于其余各组；组织厚度＞0.3cm的D与E组无皱褶、无冰晶2项指标的得分均显著低于其余各组；取材面积相同的A、B、C、D、E组5组无冰晶指标的得分按A、B、C、D、E顺序逐渐下降；取材厚度相同的F、G、B、H、I组5组无冰晶指标的得分按F、G、B、H、I顺序略有下降。可见，乳腺冷冻切片取材大小以 1cm×1cm×0.2cm至2cm×1.5cm×0.3cm 为佳（图1）。

表1 乳腺冷冻切片不同取材大小条件下3项切片质量指标得分Tab.1 Three quality index scores of frozen sections prepared from different breast tissue sizes

2 速冻方法对乳腺冷冻切片的影响

J、K、L、M、N 组5组乳腺组织完成速冻的时间分别为 65.4±7.5s、68.7±8.9s、172.3±18.7s、174.9±14.4s、173.1±20.7s，J组与K组比较，差异无统计学意义；J、K 组2组完成速冻的时间显著少于L、M、N 组3组（P均＜0.01）。J、L、M、N组4组均未发生组织块从托头上崩裂下来的现象，K组26.7%（8/30）的组织块发生从托头上崩裂下来的现象，与其他4组比较，差异均有统计学意义（P均＜0.01）。J、K、L、M、N 组5组无冰晶指标的得分分别为： 9.1±0.8、 8.9±0.9、4.6±2.4、3.7±2.2、3.1±1.6，J组与K组比较，差异无统计学意义；K、L、M、N 组4组无冰晶指标的得分按K、L、M、N顺序逐渐下降。可见，预先制作“带垫”托头的速冻方法最佳（图2）。

3 切片厚度对乳腺冷冻切片的影响

O、P、Q、R、S、T 组6组乳腺冷冻切片的切片完整、厚度均匀适中、无皱褶3项指标的得分情况见表2，由表2可见，O、P、Q 组3组切片完整指标的得分按O、P、Q 顺序逐渐上升，Q、R 组2组切片完整指标的得分差异无统计学意义，R、S、T 组3组切片完整指标的得分按R、S、T 顺序逐渐下降；O、P、Q 组3组厚度均匀适中指标的得分按O、P、Q 顺序逐渐上升，Q、R 组2组厚度均匀适中指标的得分差异无统计学意义，R、S、T 组3组厚度均匀适中指标的得分按R、S、T 顺序逐渐下降；O、P、Q 组3组无皱褶指标的得分按O、P、Q 顺序逐渐上升，Q、R、S 组3组无皱褶指标的得分差异无统计学意义（P＞0.05）。可见，切片厚度以5μm及6μm最佳（图3）。

图1 取材大小对乳腺冷冻切片的影响。A，2cm×1.5cm×0.1cm取材大小切片不完整；B，2cm×1.5cm×0.2cm取材大小切片完整；C，2cm×1.5cm×0.4cm取材大小切片皱褶、冰晶多；D，2cm×1.5cm×0.5cm取材大小切片冰晶多；比例尺，200μmFig. 1 The effect of material size on breast frozen section. A, section was incomplete with the size of 2cm × 1.5cm × 0.1cm; B, section was complete with the size of 2cm × 1.5cm × 0.2cm; C, section had more wrinkles and ice crystals with the size of 2cm × 1.5cm × 0.4cm; D, section had more ice crystals with the size of 2cm × 1.5cm × 0.5cm; scale, 200μm

图2 速冻方法对乳腺冷冻切片的影响。A，预先制作“带垫”托头的速冻方法切片冰晶少；B，未预先制作“带垫”托头的速冻方法切片冰晶多；比例尺，300μmFig. 2 The effect of quick freezing methods on breast tissue frozen section. A, quick freezing using pre-made “blanketed” support reduced ice crystals formation; B, quick freezing without pre-made “blanketed” support had more ice crystals formation; scale, 300μm

表2 乳腺冷冻切片不同切片厚度条件下3项切片质量指标得分Tab. 2 Three quality index scores of frozen sections with different section thickness

图3 切片厚度对乳腺冷冻切片的影响。A，切片厚度为3μm条件下切片不完整、厚薄不均、皱褶多；B，切片厚度为5μm条件下切片完整、厚薄均匀、皱褶少；C，切片厚度为8μm条件下切片不完整、厚薄不均、皱褶多；比例尺，100μmFig. 3 The effect of section thickness on breast frozen section. A, section was incomplete, uneven and wrinkled with a thickness of 3μm; B, section was complete, uniform, and smooth with a thickness of 5μm; C, section was incomplete, uneven and wrinkled with a thickness of 8μm; scale, 100μm

讨 论

冷冻切片技术于1818 年由Pieter deRiemer 发明，直至1905 年Wilson Mecarty 将其列为病理诊断方法之一［4］。乳腺病变在外科疾病中占有相当大的比例［5］，冷冻切片对术中制定进一步手术方案具有重要意义。

乳腺病变组织离体并及时送至病理科后，取材是影响冷冻切片质量的首要因素，除避免标本与水接触、避开坏死组织与脂肪组织，取材组织的大小将显著影响冷冻切片质量。组织小者，尤其是组织厚度＜0.2cm者，虽然速冻速度快、形成冰晶少，但组织块太小，易出现部分区域已被切完、而部分区域尚未修出的现象，导致冷冻切片不完整，如果未预先制作“带垫”的托头，容易切到冻头，且易影响冰剩组织常规切片的完整性，也容易造成漏诊；组织块太大，尤其是组织厚度＞0.3cm者，则速冻速度慢，冷冻后组织硬度大，加之需要加的包埋剂也较多，冷冻后硬度更大，切片时易出现颤痕与皱褶，且形成冰晶多，影响切片质量。所以，在不影响诊断的前提下，乳腺冷冻切片取材大小以 1cm×1cm×0.2cm至2cm×1.5cm×0.3cm 为佳。

速冻方法是影响乳腺冷冻切片质量的重要因素之一。作者预先制作了带包埋剂垫的托头，放置于预先冷冻至-25℃的冻台上备用。乳腺组织块取好后直接放于冷冻的包埋剂上，再进行后续速冻操作，既加快了速冻速度、减少形成冰晶，又增加了组织块与冻头的黏附性，避免切片时组织崩裂，也可避免组织块太薄或过度修组织块时切到托头。

切片厚度也是影响乳腺冷冻切片质量的重要因素。冷冻切片＜5μm者，常发生切片不完整、切片太薄、皱褶、裂隙；切片＞6μm者，易脱片、切片太厚，影响染色质量，不利于镜检。本实验证明，乳腺冷冻切片厚度以0.5μm～0.6μm 为佳。

本研究结果表明，通过优化乳腺组织取材大小、速冻方法、切片厚度等条件，可显著提高乳腺冷冻切片的制片效率与切片质量，为术中病理诊断及手术方案的制定提供保障。