用DNA倍体分析方法判断宫颈癌前病变的发展趋势

杨秀玮，张路伟，周亮，李莹，孙小蓉

（1喀什地区第一人民医院妇二科，喀什844000；2武汉兰丁云医学检验实验室，武汉430206）

宫颈癌的发展过程包括炎症、癌前病变（cervical intraepithelial neoplasia, CIN）[包 括 CIN1、CIN2和CIN3/ 原位癌（carcinoma in situ, CIS)]和浸润性宫颈癌等过程。癌前病变的发展趋向有3种，大多

数恢复正常，部分停留在原状态，少数发展为浸润癌[1]。而临床对癌前病变的处理也不一样：CIN1原则上不处理，CIN2、CIN3/CIS需要治疗，防止病变向浸润性宫颈癌发展。怎么判断癌前病变的发展趋势尤为重要。目前在临床上常用方法有HPV病毒测定、E6/E7、Ki67蛋白测定[2-4]。高危型HPV阳性、Ki67、E6/E7蛋白阳性都预示着病变向严重方向发展的可能，而Ki67蛋白阳性表达愈多表示病变向严重方向发展的可能性愈大。DNA异倍体测定也是一种重要的肿瘤标志物[5]，CIN病变的宫颈细胞常发现有异倍体细胞，尤其是在CIN2或CIN3病变。Grote报道在CIN1、CIN2和CIN3病例中，出现异倍体细胞率分别为54%、64%和83%[6]。Ki67蛋白是细胞进入细胞增殖周期时产生的一种蛋白质，也就是G1、S、G2和M期的细胞核内出现的蛋白质[7]。在癌前病变时进入细胞增殖周期的细胞增多，Ki67阳性细胞增多。P16蛋白常发生在HPV病毒感染后出现[8]，P16蛋白多少也可能为宫颈病变严重程度的一个标志。所以现在在临床上有人结合P16和Ki67测定方法来判断宫颈病变的发展趋势[9,10]。目前还较少研究异倍体细胞、Ki67和P16在宫颈癌前病变关系，此文探讨这三种标志物在宫颈癌前病变的表达，尤其是DNA异倍体细胞多少与Ki67和P16蛋白表达多少的相关性。

材料和方法

76例妇女参入此研究，年龄31～53岁。每位妇女在喀什人民医院门诊就诊做宫颈细胞学检测及DNA倍体分析。细胞学异常或者细胞学正常，但妇科检查肉眼观察可疑妇女，一个月内行阴道镜下宫颈组织取材，做病理组织学检查。宫颈组织蜡块切片，行Ki67和P16免疫组织化学染色。

1 宫颈细胞DNA倍体分析

用Thionin染色后的印片由全自动DNA检测分析系统（武汉兰丁医学高科技有限公司）进行扫描处理。对每张玻片上6000个以上的细胞核进行扫描测定，每个细胞核均得到500余个特征值，其中包括形态特征、吸光特征、具体结构特征、Markovian和非Markovian结构特征及长度特征等。根据不同细胞成分所具有的不同特征参数进行自动细胞分类（如正常上皮细胞、增生或异倍体细胞、淋巴细胞、中性白细胞等）和计数。凡样本内发现异倍体细胞者为阳性。根据异倍体细胞数多少，将阳性组分为三个级别：1～2个异倍体细胞为I级，3～10个异倍体细胞为II级，10个以上异倍体细胞为III级。只有二倍体细胞或少数四倍体细胞者为阴性。

2 病理组织学检查

根据WHO病理标准将76例病理病例诊断为不同类型及分成宫颈炎、CIN1、CIN2、CIN3和癌（cancer, ca）5种类型。

3 Ki67、P16免疫组织化学染色

采用免疫组织化学SP法进行Ki67（Ki67单克隆抗体，1∶100，迈瑞公司）和P16（P16单克隆抗体，1∶200，迈瑞公司）染色。常规石蜡切片切二张，一张做Ki67免疫组化，另一张做P16免疫组化，切片经脱蜡复水，切片PBS洗3次，每次5min；3%H2O2（80%甲醇）滴加在切片上，室温静置10min，PBS洗3次，每次5min；抗原修复，PBS洗3次，每次5min；滴加正常山羊血清封闭液，室温20min；滴加一抗50μL，室温静置1h或4℃过夜或37℃ 1h，4℃过夜后需在37℃复温45min，PBS洗3次，每次5min；滴加二抗50μL，室温静置或37℃ 1h，PBS洗3次，每次5min；DAB显色5min，PBS或自来水冲洗10min，苏木精复染，常规石蜡脱水透明，封片。

用Matlab软件图像测量Ki67和P16阳性细胞分布在宫颈上皮中的分布区域，以宫颈上皮基底层为起点，计数出阳性细胞在整个宫颈上皮的分布区域，以百分比计算。

4 统计方法

敏感性和特异性统计按标准公式计算，在统计CIN1、CIN2、CIN3各组DNA倍体分析组间比较用Student’s t检验，当P＜ 0.05时，表示二组之间有显著性差别。

结 果

1 76例宫颈活检病理和宫颈细胞DNA倍体分析结果

76例宫颈活检病例中发现有24例宫颈炎、25例CIN1、14例CIN2、9例CIN3和4例Ca。76例宫颈细胞DNA倍体分析发现有23例正常，20例为I级（1-2个异倍体细胞），13例为II级（3-10个异倍体细胞）和20例为III级（＞10个异倍体细胞）。在24例宫颈炎中，DNA倍体分析为17例正常、3例I级、4例II级；在25例CIN1中有4例正常、13例I级、5例II级、3例III级；在14例CIN2中，有1例正常、3例I级、2例II级、8例III级；在9例CIN3中，有1例正常、1例I级、1例II级、6例III级；在4例Ca中，1例II级、3例III级（表1）。

2 CIN2或CIN2以上病变宫颈DNA倍体分析的敏感性和特异性

若以DNA倍体1～2个异倍体（I级）为阳性诊断CIN2或CIN2以上病变的敏感性为92.5%（25/27），特异性为42.8%（21/49）。以DNA倍体3～10个异倍体（II级）为阳性，其敏感性为77.7%（21/27），特异性为75.5%（37/49）。以DNA倍体10个以上异倍体（III级）为阳性，其敏感性为45.9%（17/27），特异性为93.8%（46/49）（表2）。

表1 76例宫颈细胞DNA倍体分析及病理学Tab.1 DNA ploidy analysis and pathology diagnosis in 76 cervix biopsies

表2 宫颈DNA倍体分析的敏感性和特异性Tab.2 Sensitivity and specificity of cervical DNA ploidy analysis

3 CIN病变DNA倍体分析、Ki67和P16分析结果

将不同级别CIN病变按DNA倍体分级而分成两组，一组为DNA倍体正常、异常I级和II级，另一组为DNA倍体异常III级。

在25例CIN1病例中，有17例DNA倍体分析为正常、I及II级，其Ki67阳性面积21%，P16阳性面积为11%（图1）；有8例DNA倍体分析为III级，其Ki67平均阳性面积为43%，P16为23%。这两组之间t检验发现Ki67为0.01＜P＜0.05，P16为0.01＜P＜0.05，两组之间有显著性差别。

图1 1例宫颈上皮的病理诊断和Ki67、P16蛋白的分布。A，宫颈鳞-柱交界处，鳞状上皮处诊断为CIN1；B，Ki-67阳性核数：鳞状上皮＜5%；C，P16INK4a鳞状上皮下20%细胞核和胞质棕色反应。比例尺，100μmFig.1 Pathological diagnosis and distribution of Ki67 and P16 in cervical epithelium. A, CIN1 was diagnosed in squamous epithelium; B, Less than 5%of squamous epithelium were Ki67 positive in CIN1; C, P16INK4a positive stain was seen in 20% epithelium; scale bar, 100μm

在14例CIN2病例中，有6例DNA倍体分析为正常、I及II级，其Ki67阳性平均面积为41%，P16平均面积为35%；8例DNA倍体分析为III级，其Ki67阳性面积为65%，P16阳性平均面积为52%。两组t检验比较，Ki67为P＜0.01，P16为0.01＜P＜0.05。

在CIN3中，DNA倍体分析正常、I及II级有3例，III级有6例。前组的Ki67面积为47%，后组Ki67面积为73%，t检验0.01＜P＜0.05。前组的P16平均面积为59%，后组P16平均面积为84%，t检验0.01＜P＜0.05。两组之间Ki67和P16面积之差有显著性差别（表3）。

表3 48例CIN病变的DNA倍体分析Ki67和P16分析Tab. 3 DNA ploidy analysis and Ki67 and P16 staining in 48 cases of CIN lesions

讨 论

1 CIN2或CIN2以上病变大多伴有DNA倍体异常

在49例宫颈炎和CIN1病变中有12 位（25%）有3个或3个以上DNA倍体异常，而在27例CIN2或CIN2以上病变中已发现有20例（74%）有3个或3个以上的DNA倍体异常。此结果表明DNA倍体异常在CIN2或CIN2以上病变中发现的比例较高，即病变愈严重、宫颈细胞内DNA倍体异常愈常见，很多研究均有类似的报道。DNA倍体异常作为肿瘤标记物之一[5]，宫颈细胞若发现DNA倍体异常，患者需进一步检查来确诊其病理性改变，以免延误病情。

2 DNA倍体异常与Ki67和P16一样可指示宫颈病变的严重程度

宫颈CIN病变为宫颈癌癌前病变，CIN1绝大部分可恢复正常，很少发展为肿瘤。而CIN2或CIN3大多可恢复正常或持续停止状态，并不会向肿瘤方向发展，只有少数病变会发展到浸润癌[1]，所以临床或研究上如何判断病变的发展状态尤为重要。目前临床上常用高危型HPV、宫颈组织的Ki67和P16蛋白标记来判断癌变的发展趋势。当Ki67和P16蛋白布满宫颈上皮全层，多提示病变较严重，有发展为宫颈浸润癌的趋势[1]。若这些阳性蛋白只分布在宫颈上皮基层或中下层，多提示病变不活跃，发展为浸润癌的概率较低。本文研究结果表明，DNA倍体分析可与Ki67和P16一样，用于判断宫颈病变的发展趋势。10个以上异倍体细胞宫颈上皮中下多伴73% Ki67和84% P16蛋白阳性表达。DNA倍体异常细胞愈多，说明其DNA染色体愈不稳定，Ki67和P16表达愈多，这种病变的严重发展可能性愈大，相反病变可恢复正常或停止在原处。

3 可用DNA倍体异常细胞来判断宫颈病变敏感性和特异性

在宫颈筛查时，常需要了解筛查方法在判断宫颈疾病的敏感性和特异性。敏感性即为阳性病例的检出率，特异性即阴性病例的正确判断率。敏感性与特异性是一对矛盾体，敏感性愈高，特异性愈低。目前在国外用TBS诊断标准人工诊断CIN2或CIN2以上级别疾病的敏感性为42%～72%左右[11]，而此技术使用10个以上的DNA倍体异常为标准诊断CIN2或CIN2以上级别疾病的敏感性可达46%左右，而特异性可达到94%左右。因此此技术可在缺少病理学医生的地方发挥巨大作用。我国目前宫颈癌筛查量大，医生缺乏，将此技术用于宫颈癌筛查也是一种有效方法。

总之，CIN2或CIN2以上病变多伴有DNA倍体异常，与Ki67和P16作用一样，DNA倍体异常可作为一个重要肿瘤标记物之一来判断CIN病变的发展趋势。由于此技术可达到较高的敏感性，在一些病理医生匮乏地区，可用作宫颈癌检查方法之一。