毛蕊花糖苷通过调控BDNF-TrkB信号通路改善CUMS大鼠的抑郁样行为*

邓海峰， 孙缦利， 吴 琼， 常全忠

(漯河医学高等专科学校， 河南 漯河 462000)

毛蕊花糖苷(acteoside, Act)是毛蕊花属植物中的主要活性成分之一，现代药理学研究证实，毛蕊花糖苷具有滋阴补肾、降血糖、降血脂、抗衰老和抗肿瘤等作用[1-3]。近年来研究发现，毛蕊花糖苷可以通过抗氧化、抗炎和抗凋亡等途径对中枢神经系统具有有效的保护作用[4-5]。抑郁症也属于中枢神经系统疾病，毛蕊花糖苷对抑郁症是否有疗效，目前还未见研究报道。本研究旨在通过慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)结合孤养的方式建立抑郁症模型大鼠，探讨毛蕊花糖苷对大鼠抑郁样行为的影响及可能机制，以期为临床上预防和治疗抑郁症提供理论和实验依据。

材 料 和 方 法

1 动物

108只健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，清洁级，体重200～220 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物合格证编号为SCXK(湘)2011-0003。动物自由觅食、饮水，在自然光暗周期的环境中饲养。

2 主要仪器和试剂

Mini-PROTEAN3电泳系统、 Mini Trans-Blot转移系统和ChemiDocTMXRS+凝胶成像系统均购自Bio-Rad；Multiskan MK3全自动酶标仪购自Thermo；FluoView FV1200激光共聚焦显微镜购自OLYMPUS。毛蕊花糖苷购自南京景竹生物科技有限公司；盐酸氟西汀(fluoxetine, 20 mg)购自美国礼来苏州制药有限公司；兔抗脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)和原肌球蛋白受体激酶B(tropomyosin receptor kinase B, TrkB)多克隆抗体均购自Abcam；抗β-actin抗体、FITC标记山羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG (H+L)均购自碧云天生物技术公司；检测5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、多巴胺(dopamine，DA)和去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)的 ELISA试剂盒购自上海酶联生物。

3 主要方法

3.1CUMS模型的建立 动物适应性饲养1周后开始实验。采用CUMS结合孤养的方式制备CUMS抑郁症模型。应激包括禁食24 h、禁水24 h、昼夜颠倒24 h、45 ℃热水游泳5 min、4 ℃冰水游泳5 min、悬尾20 min、夹尾2 min、潮湿垫料24 h等8种方式，每天随机给予1种应激方式，但相邻2 d给予不同方式应激，使应激具有不可预见性，共持续28 d。

3.2动物分组及给药 成模后将大鼠随机分为5组：模型(model)组、盐酸氟西汀组和毛蕊花糖苷低、中、高剂量(Act-30 mg/kg、Act-60 mg/kg和Act-120 mg/kg)组，每组18只;另取18只正常大鼠作为对照(control)组。在造模结束1周后，盐酸氟西汀组灌胃盐酸氟西汀(20 mg/kg)，毛蕊花糖苷各剂量组分别灌胃毛蕊花糖苷(30 mg/kg、60 mg/kg和120 mg/kg)，对照组及模型组在相同时间灌胃等体积的生理盐水。每天固定时间给药1次，连续3周。末次给药24 h后进行行为学实验。

3.3强迫游泳实验 实验装置为上口径40 cm、下口径33 cm的不透明圆形塑料桶，水深30 cm，水温(24±1) ℃，实验时保持安静。将大鼠头部面向桶壁，缓慢放入塑料桶内，让其自由游泳，用秒表记录大鼠5 min内的不动时间(动物四肢不动漂浮于水面，仅头部露出水面呼吸或四肢偶尔划动以保持身体不至于沉下去，即为不动)。5 min后将大鼠取出并用毛巾擦干后放回鼠笼。

3.4糖水偏好实验 糖水偏好实验分为2个阶段，第一阶段为糖水适应性训练：一笼一鼠，每个鼠笼放置2个装有200 mL 1%蔗糖溶液的水瓶24 h；第二阶段为糖水偏好测量：适应性训练结束后立即禁食禁水24 h，之后同时放置1瓶纯水和1瓶1%蔗糖溶液(均为200 mL)，0.5 h后调换2瓶位置，继续放置，0.5 h后测量并计算每只大鼠的糖水偏好量,糖水偏好量(%)=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)×100%。

3.5免疫荧光实验 行为学实验结束后，每组随机选取6只大鼠断头取脑，经心脏灌流，冰冻切片。所得切片经破膜、封闭处理后，滴加兔抗BNDF抗体(1∶500)，4 ℃孵育48 h，后加入FITC标记的IgG(1∶1 000)室温孵育2 h，90%甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察、拍照，利用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件测定积分吸光度(integrated absorbance，IA)。

3.6Western blot实验 每组随机选取6只大鼠，断头取脑，冰上分离海马组织，剪刀剪碎、称重，加入裂解液，冰上用玻璃匀浆器匀浆，12 000 r/min低温离心10 min，吸取上清，BCA法进行蛋白定量，加入5×Laemmil蛋白上样缓冲液，100 ℃水浴5 min，-80 ℃保存备用。实施10% SDS-PAGE，浓缩胶电压80 V，15 min，分离胶电压120 V，直至溴酚蓝跑到分离胶底部。转膜1 h，5%脱脂奶粉4 ℃过夜封闭，TBST洗膜，加入I 抗(TrkB为1∶200，β-actin为1∶200)室温孵育1 h，TBST洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的 II 抗(1∶5 000)室温孵育1 h，TBST洗膜，将膜置于凝胶成像仪中，加入ECL发光剂，曝光显影，采用ImageJ软件分析蛋白水平。

3.7ELISA实验 10%水合氯醛麻醉大鼠，断头取出新鲜脑组织，称重，加入预冷的PB缓冲液，冰上用玻璃匀浆器匀浆，12 000 r/min低温离心15 min，提取上清液，检测5-HT、DA和NE的含量。实验步骤严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

4 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件与GraphPad Prism 5.0软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组均数间的两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 毛蕊花糖苷改善CUMS大鼠抑郁样行为

强迫游泳实验和糖水偏好实验结果显示，与对照组相比，模型组大鼠的强迫游泳不动时间明显延长，糖水偏好量明显降低(P<0.05)；与模型组相比，盐酸氟西汀组和毛蕊花糖苷各剂量组大鼠的强迫游泳不动时间明显缩短，糖水偏好量明显提高(P<0.05)，见表1。

表1毛蕊花糖苷对CUMS大鼠抑郁样行为的影响

Table 1. The effect of acteoside (Act) on depression-like beha-viors in CUMS rats (Mean±SD.n=18)

GroupImmobility time (s)Sugar intake (%)Control71.52±13.4378.64±11.16Model165.75±27.02#40.57±6.39#Fluoxetine95.27±15.36∗59.24±7.30∗Act-30 mg/kg127.38±20.92∗52.73±7.18∗Act-60 mg/kg113.64±17.53∗57.04±7.92∗Act-120 mg/kg92.72±13.17∗62.75±9.83∗

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

2 毛蕊花糖苷增加CUMS大鼠海马BDNF阳性神经元数量

各组大鼠海马BDNF阳性神经元表达情况见图1，被标记上绿色的为阳性神经元。定量分析结果显示，与对照组相比，模型组海马BDNF阳性神经元的数量明显减少(P<0.05)；与模型组相比，盐酸氟西汀组和毛蕊花糖苷各剂量组海马BDNF阳性神经元的数量明显增加(P<0.05)。

3 毛蕊花糖苷提高CUMS大鼠海马TrkB蛋白表达水平

各组大鼠海马的TrkB蛋白表达情况见图2,与对照组相比，模型组大鼠海马的TrkB蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组相比，盐酸氟西汀组和毛蕊花糖苷各剂量组大鼠海马的TrkB蛋白表达水平显著提高(P<0.05)。

Figure 1. The observation of BDNF positive neurons in the hippocampus of rats (immunofluorescence staining, ×200). Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

图1免疫荧光染色观察大鼠海马BDNF阳性神经元

4 毛蕊花糖苷提高CUMS大鼠脑内5-HT、DA和NE的含量

与对照组相比，模型组脑组织的5-HT、DA和NE含量明显降低(P<0.05)；与模型组相比，盐酸氟西汀组和毛蕊花糖苷各剂量组的5-HT、DA和NE含量明显增加(P<0.05)，见表2。

Figure 2. The protein expression of TrkB in the hippocampus of rats determined by Western blot. Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

图2Westernblot检测海马TrkB蛋白的表达水平

表2毛蕊花糖苷对CUMS大鼠脑内5-HT、DA和NE含量的影响

Table 2. The effect of acteoside (Act) on 5-HT, DA and NE levels in the brain of CUMS rats (ng/L. Mean±SD.n=6)

Group5-HTDANEControl448.36±24.1764.25±10.91127.46±14.05Model304.52±19.81#48.43±8.32#93.52±12.63#Fluoxetine383.73±21.64∗56.28±11.04∗112.85±13.17∗Act-30 mg/kg357.29±18.47∗55.37±9.26∗107.37±12.42∗Act-60 mg/kg370.58±23.36∗56.84±10.45∗113.44±14.35∗Act-120 mg/kg391.42±22.70∗59.66±11.27∗116.68±13.71∗

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

讨 论

抑郁症是临床上常见的一种精神科疾病，主要表现有持续的心情低落、行动迟缓、焦虑和认知能力下降等临床症状，具有自杀率高、自残率高和易复发等特点，严重降低患者的生活质量，同时给患者家庭带来了严重的精神和经济负担[6]。因此，阐明抑郁症的发病机制及寻找安全、有效的抗抑郁药已成为医学科学界亟待解决的问题。

本研究制备抑郁症大鼠所采用的CUMS加孤养方式，是目前国际上广泛使用的抑郁症模型，已被证实可以很好地模拟抑郁症患者的核心症状(即快感缺失)和行为方式(如行动迟缓、探索能力下降)[7]。本实验的研究结果显示，抑郁模型组大鼠在强迫游泳实验中的不动时间较正常对照组明显缩短，且对蔗糖的偏好度明显降低，表明抑郁大鼠模型制备成功。

盐酸氟西汀是一种5-羟色胺再摄取的选择性抑制剂，能显著改善抑郁模型动物的抑郁行为，是国内外研究抑郁症的常用阳性对照药物[8-9]。本实验也选用盐酸氟西汀作为毛蕊花糖苷的阳性对照药物。在抑郁模型大鼠制备成功的基础上，本课题组首先观察毛蕊花糖苷对抑郁大鼠行为学的影响，发现灌胃给予毛蕊花糖苷后可以明显改善大鼠的抑郁样行为，其抗抑郁效果同盐酸氟西汀。

虽然抑郁症的发病机制尚未阐明清楚，但越来越多的研究表明脑区BDNF-TrkB信号通路参与抑郁症的发生发展过程[10-12]。BDNF是神经营养因子家族中的重要成员，广泛分布于中枢神经系统，尤以海马和皮层的分布最为丰富。BNDF通过与其亲和力高的特异性受体TrkB结合，启动下游一系列信号转导过程，发挥其对神经系统的生物学作用，包括促进神经元的存活、发育、生长和分化以及调节突触可塑性和神经再生等过程[13]。Li等[14]研究发现褪黑素可以通过上调BDNF-TrkB信号通路增强盐酸氟西汀的抗抑郁效应；Duan等[15]报道电针治疗抑郁症的机制是增强中枢BDNF和TrkB的蛋白表达水平以及mRNA水平；Pandya等[16]发现在小鼠脑内过表达谷氨酰胺转胺酶2可以通过下调BDNF-TrkB信号通路产生抑郁效应,以上研究均表明BDNF-TrkB信号通路和抑郁症的发生有密切关系。那么毛蕊花糖苷的抗抑郁机制是否和BDNF-TrkB信号通路有关呢？本研究于行为学实验结束后，利用免疫荧光和Western blot法检测各组大鼠海马BDNF和TrkB的表达水平。结果发现模型组大鼠的BDNF和TrkB表达水平较对照组显著下降，而经过毛蕊花糖苷治疗后，大鼠BDNF和TrkB表达水平显著提高，表明毛蕊花糖苷可能通过上调BDNF-TrkB信号通路发挥其抗抑郁效应。

1965年有学者提出抑郁症发病机制的“单胺类递质假说”，得到众多研究者的证实支持，该假说认为，抑郁症的发生与中枢神经系统内单胺类递质水平或功能下降有关[17]。中枢内的单胺类递质主要有5-HT、DA和NE。有研究认为，5-HT可通过5-HT1A受体对谷氨酸(glutamate，Glu)进行调节，Glu是脑内重要的兴奋性递质，当慢性应激引起5-HT水平下降时，会导致突触后膜上5-HT1A受体功能降低，进而使Glu能兴奋性突触过度激活，突触间的信息传递紊乱，导致抑郁症的发生[18]；DA可通过D1受体调节Glu及其受体NMDA受体水平，研究表明CUMS诱发的抑郁大鼠脑内DA水平降低，Glu和 NMDA 受体中的NR2B 亚基升高[19]；NE是交感节后神经元末梢释放的神经递质，其水平降低会引起交感神经兴奋性降低，从而出现抑郁症状[20]。毛蕊花糖苷的抗抑郁机制是否与上述单胺类递质水平变化有关呢？本研究通过ELISA法检测各组大鼠脑组织内5-HT、DA和NE的含量并作出统计，结果发现抑郁模型组大鼠脑内单胺类递质的含量较正常对照组显著减少，经过毛蕊花糖苷治疗后，单胺类递质水平均明显提高，表明毛蕊花糖苷可能通过提高脑内单胺类递质水平改善CUMS大鼠的抑郁样行为。

综上所述，本研究采用CUMS加孤养方式，制备抑郁大鼠模型并用行为学实验验证，而毛蕊花糖苷可以改善CUMS大鼠的抑郁样行为，具有抗抑郁效应，其抗抑郁机制可能与上调海马BDNF-TrkB信号通路、提高脑内单胺类递质水平有关，但具体作用机制还需进一步研究明确。