千金藤素通过调节eIF4E相关miR-215促进RL-952细胞凋亡*

李美霞， 张菡菡

(1滨州医学院， 山东 烟台 264003； 2高青县人民医院妇产科， 山东 高青 256300)

子宫内膜癌是女性生殖道三大恶性肿瘤之一，为起源于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤，目前在临床上以手术治疗为主，但晚期和转移患者可选治疗措施较少，主要依赖化疗，而化疗副作用是导致患者治疗失败的主要问题。因此，探寻更为低毒有效的治疗药物是目前子宫内膜癌治疗的一大需求。

千金藤素(cepharanthine，CEP)提取自传统中药千金藤，是一类异喹啉类生物碱[1]，具有调节免疫、稳定质膜、抗炎及增强肿瘤细胞对化疗的敏感性[2]等作用。越来越多的研究显示，千金藤素在对抗肿瘤的发生发展中亦有着重要作用，千金藤素可以促进包括人类白血病细胞系[3]、胆管癌细胞[4]和口腔鳞癌细胞[5]等多种恶性肿瘤细胞的凋亡。

微小RNA(microRNA， miRNA， miR)是一类长约22 nt的非编码RNA，广泛存在于真核生物中, 主要参与转录后基因表达的调控[6-7]。 miRNA可以与其靶基因mRNA分子的3’ 端非翻译区(3’-untranslated region，3’-UTR)互补配对结合，进而引起该mRNA的翻译抑制或者降解，是一种天然的RNAi 诱导分子[8]。有报道显示,用人工miRNA引发靶向目的基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi),比shRNA的抑制效率更高，因此miRNA被作为抑制肿瘤等疾病相关基因的潜在疗法。本实验室前期研究结果证实，千金藤素可以通过抑制miR-150和miR-182的表达而分别上调p53和FOXO1，从而抑制肺癌A549细胞的生长，促进其凋亡[9],提示我们千金藤素可以通过影响miRNA的表达来实现对下游癌基因和抑癌基因的调控，miRNA可能是千金藤素在体内发挥抗癌作用的靶点。本实验研究了千金藤素对人子宫内膜癌RL-952细胞活力和凋亡的影响，并检测了细胞内miR-215的变化，探讨千金藤素能否通过调节miR-215的表达来进一步影响人子宫内膜癌细胞生长。

材 料 和 方 法

1 材料

人子宫内膜癌RL-952细胞由大连医科大学生物化学与分子生物学教研室惠赠。miR-215由上海吉玛公司合成；千金藤素、DMSO和MTT购自Sigma；DMEM/F12培养基和胎牛血清购自Gibco；miRNA提取及反转录试剂盒购自TaKaRa；兔抗人真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)及p-eIF4E单克隆抗体购自BioWorld；羊抗兔IgG购自北京中杉金桥公司。

2 主要方法

2.1细胞培养 从液氮中取出RL-952细胞，迅速放入37 ℃温水中快速摇动使其融化，离心后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，接种于培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中正常培养。

2.2MTT法检测细胞活力 取对数生长期的细胞，按照每孔5.0×103个的密度接种于96孔板，24 h后弃去孔中旧培养基，将稀释好的千金藤素按照0、10、20、30和40 μmol/L的浓度来处理细胞，每个浓度设6个复孔。24 h 后每孔加入100 μL含10% MTT的无血清DMEM/F12培养基继续培养4 h，后吸弃上清，每孔加入100 μL DMSO，避光振荡10 min，酶标仪中选取490 nm波长检测，读取各孔吸光度(A)值。计算公式如下：细胞活力抑制率=1-A实验组/A对照组。

2.3流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡 取对数生长期的细胞，按照每孔2.0×105个的密度接种于6孔板，24 h后用千金藤素按照0、10、20、30和40 μmol/L的浓度来处理细胞，药物作用24 h后，胰酶消化收集细胞后，用无菌PBS洗涤细胞2次，离心后收集细胞沉淀，每管加入500 μL 1×Binding Buffer 重悬细胞后，加入5 μL Annexin V-FITC，混匀，再加入5 μL propidium iodide(PI)混匀，室温避光反应15 min，1 h内用流式细胞仪检测。

2.4Real-time PCR检测最佳有效浓度的千金藤素作用后miR-215的表达 取对数生长期的细胞接种于6孔板，24 h后用30 μmol/L千金藤素处理细胞，胰酶消化收集细胞后，应用RNAiso for Small RNA 提取细胞总小RNA，然后进行加尾、反转录生成cDNA, real-time PCR检测细胞内miR-215的表达情况，5S rRNA作为反应内参照。miR-215的上游引物序列为5’-ATGACCTATGATTTGACAG-3’， 5S rRNA的上游引物序列为5’-GCCATACCACCCTGAACG-3’， 通用下游引物序列为5’-AACATGTACAGTCCATGGATG-3’。Real-time PCR为20 μL体系，反应条件为：95 ℃ 1 min； 95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，重复40个循环。60 ℃至95 ℃绘制熔解曲线。

2.5Western blot 检测千金藤素对eIF4E及p-eIF4E蛋白水平的影响 取对数生长期的RL-952细胞接种于6孔板，千金藤素(30 μmol/L)加入孔中，37 ℃培养箱中培养48 h后收集细胞，加入RIPA提取细胞总蛋白，按照每孔40 μg的上样量加入浓缩胶孔开始电泳, 电压80 V，至样品迁移至浓缩胶与分离胶交界处时，改为100 V，电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜，7%封闭液封闭2 h，洗膜后加I 抗4 ℃封闭过夜，洗膜，加II 抗封闭2 h，曝光显影并拍照。

2.6荧光显微镜和流式细胞术检测GFP表达情况 实验共分为4组，分别为空白对照(blank control)组、阴性对照(negative control，NC)组、pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR单质粒转染(GFP-eIF4E-3’UTR)组和pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR+miR-215共转染(miR-215)组。取对数生长期的RL-952细胞接种于6孔板，除空白对照组外，后3组用Lipofectamine 2000分别转染1 μg negative control mimics、1 μg pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR质粒及1 μg miR-215 mimics和1 μg pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR质粒，6～8 h后换液，48 h后荧光倒置显微镜下观察各组荧光强度并拍照，拍照结束后，收集各组细胞经流式细胞仪检测各组GFP表达情况。

2.7Western blot检测miR-215转染后eIF4E及p-eIF4E的蛋白水平 细胞转染实验分为3组：正常对照组、阴性对照组和miR-215转染组。取对数生长期的RL-952细胞接种于6孔板，miR-215转染组和阴性对照组分别用Lipofectamine 2000转染miR-215 mimics和negative control mimics入细胞，6～8 h后换液，48 h后收集细胞提取总蛋白，行Western blot检测，步骤如前。

3 统计学处理

运用SPSS 16.0进行统计学分析。实验数据均以均数±标准差(mean±SD)表示，两组间均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 千金藤素使RL-952细胞活力下降

分别采用0、10、20、30和40 μmol/L的千金藤素处理RL-952细胞后，细胞活力的抑制率均明显升高(P<0.01)，并呈一定的剂量依赖性，达到30 μmol/L后再增大药物浓度，细胞活力的抑制率不再升高，提示此浓度可作为最佳有效浓度来进行后续实验，见图1。

Figure 1. The effect of CEP on the viability of RL-952 cells detected by MTT assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

图1MTT法检测不同浓度千金藤素对RL-952细胞活力的影响

2 光镜检测不同浓度的千金藤素对RL-952细胞形态的影响

光镜下可见，不同浓度的千金藤素处理RL-952细胞24 h后，随着药物浓度的升高，细胞数目逐渐减少，细胞皱缩、变圆、脱壁，悬浮死细胞增多，见图2。

Figure 2. The morphological changes of RL-952 cells treated with CEP at different concentrations observed under inverted microscrope (×100).

图2倒置显微镜下观察不同浓度千金藤素对RL-952细胞形态的影响

3 Annexin V-FITC/PI双染检测不同浓度的千金藤素对RL-952细胞凋亡的影响

流式细胞术结果显示，千金藤素处理细胞24 h后，随着药物浓度的增加，细胞凋亡率逐渐增加(P<0.01)，可见千金藤素可以诱导RL-952细胞凋亡，见图3。

Figure 3. The effect of CEP on the apoptotic rate of RL-952 cells analysis by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

图3流式细胞术检测不同浓度千金藤素对RL-95细胞凋亡的影响

4 Real-time PCR检测千金藤素对RL-952细胞中miR-215表达的影响

30 μmol/L的千金藤素处理RL-952细胞24 h后，miR-215的表达水平较对照组显著升高(P<0.01)，提示该浓度的千金藤素可有效上调RL-952细胞中miR-215的表达，见图4。miR-215在子宫内膜癌中具有抑癌基因的功能，千金藤素诱导的RL-952细胞凋亡可能通过升高miR-215的表达来实现。

5 Western blot检测千金藤素对RL-952细胞中eIF4E及p-eIF4E蛋白水平的影响

30 μmol/L的千金藤素处理RL-952细胞48 h后，Western blot结果显示药物处理组eIF4E/GAPDH和p-eIF4E/GAPDH均较对照组降低(P<0.05或P<0.01),见图5。

Figure 4. The effect of CEP on the expression of miR-215 in the RL-952 cells detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

图4Real-timePCR检测千金藤素对RL-952细胞miR-215表达的影响

Figure 5. The protein levels of eIF4E and p-eIF4E in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

图5Westernblot检测千金藤素作用后eIF4E及p-eIF4E的表达结果

6 miR-215与eIF4E相关性研究

通过microrna.org(http://www.microrna.org/)生物信息学软件预测，显示eIF4E的3’UTR存在miR-215的结合位点,见图6。

Figure 6. The result of bioinformatic analysis to predict target genes of miR-215 by software searching.

图6生物信息学软件预测eIF4E为miR-215的靶基因

检测GFP表达以观察miR-215对pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR的调控作用。荧光显微镜显示，pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR+miR-215转染组荧光强度较阴性对照组和单质粒转染组明显减弱，见图7A；流式细胞术检测pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR+miR-215转染组GFP阳性率为7.85%，与阴性对照组和单质粒转染组比较显著降低(P<0.05)，见图7B。以上结果提示eIF4E为miR-215的靶基因，miR-215可有效下调eIF4E的表达。

7 miR-215对RL-952细胞中eIF4E及p-eIF4E蛋白水平的影响

Western blot结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比，miR-215转染组p-eIF4E表达显著降低(P<0.01)，eIF4E表达亦降低(P<0.05)，见图8。

讨 论

千金藤素具有抗炎、抗多药耐药、治疗银屑病和增强肿瘤细胞放化疗敏感性等作用，且未发现有明显的临床毒副作用，其在多种肿瘤中的作用逐渐被发现，但尚未见到子宫内膜癌中的作用研究报道。本研究的结果证实，千金藤素可抑制人子宫内膜癌RL-952细胞的增殖，促进其凋亡，并呈现一定的剂量依赖性，这提示千金藤素可以作为临床子宫内膜癌治疗的潜在药物。

本研究尝试从miRNA角度入手进一步研究其机制。miRNA在基因表达调控中发挥重要作用，在肿瘤发生发展中扮演癌基因或者抑癌基因的重要角色。已有报道显示，miR-215在结直肠肿瘤[10]和非小细胞肺癌[11]等肿瘤中发挥着抑癌基因的作用，而在胃癌[12]和宫颈癌[13]等组织中则发挥着癌基因的作用。关于miR-215在子宫内膜癌中的作用，Karaayvaz等[14]的结果显示，miR-215在48例子宫内膜癌中的表达和癌旁组织中比较差异无统计学意义，而Gao等[15]的报道则显示miR-215通过下调LEFTY2促进了HEC-1A细胞的EMT和增殖过程。本研究结果显示，有效浓度的千金藤素作用后，miR-215表达上调，而生物信息学软件分析得到癌基因eIF4E的3’UTR存在miR-215的结合位点，因此我们推测千金藤素对子宫内膜癌增殖和凋亡的影响可能是通过影响了miR-215进而下调了eIF4E的表达而实现的。

eIF4E是真核生物翻译起始复合物eIF4F复合体(eIFR3、eIF4A 和eIF4G)的一部分，是真核翻译起始复合物最有效的成分之一；另外，eIF4E还调控着mRNA从细胞核向核糖体的输出[16-17],这些都是启动翻译的关键步骤，因此eIF4E在蛋白质翻译起始阶段起着有效的调控作用，其过表达或激活所导致的翻译失调和多种肿瘤的发生发展密切相关。作为一种新型原癌基因，eIF4E在多种肿瘤的发生发展中起到了重要作用。2011年Choi等[18]第一次报道了eIF4E在子宫内膜癌中高表达，且与子宫内膜癌的临床分期呈正相关，应用RNAi技术下调eIF4E表达可有效抑制子宫内膜癌细胞的增殖。在本研究中我们发现，当有效浓度的千金藤素作用于RL-952细胞后，eIF4E及其活性形式p-eIF4E表达均有下调， 提示eIF4E可能是千金藤素下游的靶基因。我们进而将人工合成的miR-215作用于RL-952细胞后，同样看到了eIF4E及其磷酸化形式p-eIF4E的下调。结合上述real-time PCR结果，我们得到以下结论，千金藤素可有效抑制人子宫内膜癌RL-952细胞的活力，并促进其凋亡，其机制主要通过上调miR-215的表达，进而抑制eIF4E及其活性形式p-eIF4E的表达来实现。这为千金藤素作为临床子宫内膜癌的辅助治疗药物提供了理论依据。

Figure 7. The expression of GFP detected by fluorescence microscropy (A) and flow cytometry (B). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group.

图7荧光显微镜及流式细胞术检测GFP表达

Figure 8. The protein levels of eIF4E and p-eIF4E after miR-215 transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图8Westernblot检测miR-215转染后eIF4E及p-eIF4E的蛋白水平