慢病毒介导IGF—1基因修饰肌源性干细胞移植治疗雌性压力性尿失禁大鼠的实验研究

陈春经

【摘要】 目的：探讨IGF-1基因修饰的肌源性干细胞（MDSCs）移植治疗雌性压力性尿失禁大鼠的作用及可能机制。方法：尿失禁大鼠随机分对照组即MDSCs移植组（n=15）和治疗组即IGF-1基因修饰的MDSCs移植组（n=15），以1×106个MDSCs/只注入尿道距膀胱约0.5 cm处，评价注射后尿道闭合功能情况、VEGF的表达情况及移植细胞存活情况。结果：与对照组比较，治疗组膀胱最大容量及腹压漏尿点压（ALPP）均升高，但差异无统计学意义（P>0.05）；细胞存活数、VEGF蛋白表达量显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：IGF-1基因修饰的MDSCs增强了其在移植环境中的生存能力，并通过其旁分泌功能，可能为治疗压力性尿失禁提供了一种新的方法。

【关键词】：胰岛素样生长因子-1； 肌源性干细胞； 压力性尿失禁； 生存能力

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.14.073 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2018）14-0-03

Therapeutic Efficacy of Lentiviral Vector Mediated IGF-1 Gene-Modified Muscle-Derived Stem Cells in Rats with Female Stress Urinary Incontinence/CHEN Chunjing.//Chinese and Foreign Medical Research，2018，16（14）：170-172

【Abstract】 Objective：To explore that whether muscle-derived stem cells（MDSCs） pretreated with IGF-1 could promote urethral sphincter restoration in pudendal nerve-transected rat model.Method：Rats with Female Stress Urinary Incontinence were randomly divided into IGF-1/MDSCs injection group（the experimental group，n=15） and MDSCs injection group（the control group，n=15）.MDSCs survival，urethral resistance function，western blot were carried out.Result：Compared with the control group，the maximum capacity of the bladder and abdominal leak point pressure（ALPP） were all increased（P>0.05），and the number of cells survival and expression of VEGF protein were increased significantly in the experimental group（P<0.05）.Conclusion：MDSCs pretreated with IGF-1 that enhance their viability in the transplant environment and through their paracrine function may provide a new way to treat stress urinary incontinence.

【Key words】 IGF-1； Muscle-derived stem cell； Stress urinary incontinence； Viability

First-authors address：Sanming First Hospital Affiliated to Fujian Medical University，Sanming 365000，China

全球约有2亿多尿失禁患者，其中女性是男性的2～3倍，严重影响生活质量。且随着年龄的增长，发病率显著上升，其中压力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是最常见的类型[1]。其发病机制主要包括尿道高活动性和尿道固有括约肌功能障碍（intrinsic sphincter deficiency，ISD）[2]。老年女性SUI患者，几乎均合并存在ISD[3]，现有的治疗方法尚不能完全解决伴有ISD的SUI患者的尿道括约肌闭合功能问题。因此，迫切需要从本质上寻求一种方法以改善尿道括约肌结构和功能缺陷。肌源性干细胞移植可以修复和改善骨骼肌功能[4-5]，尿道横纹肌与骨骼肌同源，因此，肌源性干細胞移植也成为伴有ISD的SUI的一个研究热点。而随着年龄的增长，机体局部缺血缺氧、氧化应激等不利因素均可导致植入的干细胞存活率下降，进而影响细胞移植的治疗效果，因此，如何改善移植微环境、促进移植干细胞的存活，是首要解决的问题。研究发现结合外源性生长因子如FGF、HGF、PDGF等可以改善移植微环境，有利于植入到体内干细胞的定植、生长和分化[6]。签于此，本研究探讨IGF-1基因修饰的MDSCs移植治疗雌性SUI大鼠的作用及可能机制，旨在寻求一种最佳治疗SUI的方案。

1 材料与方法

1.1 主要材料

取近交系健康未孕雌性Wistar大鼠30只，3～4周龄，级别为SPF级，合格证号：SCXK（沪）。随机分为两组：MDSCs组（对照组）和IGF1/MDSCs组（治疗组），每组15只，其次每组按术后1周、2周、4周再均分为3个亚组，每个亚组5只。激光共聚焦显微镜（德国Zeiss，LCSM510），尿动力仪（加拿大Labrie）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠SUI模型建立 以双侧阴部神经切断（Pudendal Nerve-Transected，PNT）的方法[7]，制备大鼠SUI模型。（1）麻醉、固定、备皮、术区消毒；（2）取背侧纵形切口，手术显微镜下找到相对粗大的坐骨神经；（3）沿坐骨神经走行，在其进入闭孔发出分叉处找到阴部神经；（4）切断双侧阴部神经约2 mm；（5）缝合切口；（6）备行后续实验。

1.2.2 MDSCs注射治疗SUI大鼠模型 各组在距膀胱约0.5 cm处尿道近端的3、9点处进针注射含有约1×106个MDSCs和IGF1/MDSCs悬液，使局部隆起，注射细胞后留针约10 s，后缓慢出针。

1.2.3 尿动力学检查注射后各组大鼠尿控功能 所有大鼠分别于注射后1、2、4周行最大膀胱容量及腹压漏尿点压（Abdominal Leak Point Pressure，ALPP）检测。（1）行尿动力学检查前的准备工作；（2）麻醉、固定、暴露膀胱，于膀胱顶部做荷包缝合，荷包中央植入软质硬膜外麻醉导管，另端经皮下隧道固定于大鼠颈背部；（3）检测时于颈部导管埋藏处将导管挑出，插入一号注射针头，经三通管分别连接灌注泵和压力传感器；（4）人工排空膀胱并校零后，以5 ml/h的速度灌注含美兰的无菌生理盐水观察膀胱压力上升情况；一旦尿道口有蓝色液体溢出，停止灌注，记录此时膀胱容量即最大膀胱容量。人工排空膀胱并校零后，以同样速度灌注达膀胱容量的一半，缓慢地按压腹部直到出现漏尿，此时的膀胱峰压即为ALPP，测定三次，取平均值。

1.2.4 多重免疫荧光化学染色 细胞注射治疗后1周行尿动力学检测后分别处死各组动物，观察各组细胞在组织内的存活情况。（1）断颈法处死大鼠，暴露尿道；（2）剪取注射部位约0.5 cm长度的近端尿道，加入O.C.T冷冻包埋剂，置-80 ℃超低温冰箱保存；（3）将O.C.T包埋组织使用恒温冰冻切片机制成厚约8 μm的冰冻切片；（4）冰丙酮固定10 min后冻存于-20 ℃低温冰箱，用于多重免疫荧光染色；（5）对收集的标本取三片非连续的8 μm薄片进行多重免疫荧光化学检测，每张切片在移植细胞分布区随机取5个视野，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统计算每个视野移植细胞数（个/HP），取其平均值作为该标本的细胞数。

1.2.5 Western-blot分析VEGF蛋白的表达 细胞注射治疗后4周行尿动力学检测后分别处死各组动物，观察各组VEGF蛋白的表达情况。取0.5 cm注射部位近端尿道，通过细胞收集，蛋白提取及测定，电泳分离，免疫印迹（湿转），免疫显色，图像分析，灰度值计算，以目标蛋白条带的灰度值与内参蛋白的积分吸光度值比值表示待测蛋白的相对表达水平。

1.3. 统计学处理

采用SPSS 18.0软件处理，计量资料以（x±s）表示，采用t检验。检验水准ɑ=0.05，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IGF-1基因修饰MDSCs对大鼠SUI模型尿动力学的影响

与对照组（MDSCs组）比较，治疗组（IGF1/MDSCs组）在治疗1、2、4周后，膀胱最大容量和ALPP均升高，但差异无统计学意义（P>0.05），见表1、表2。

2.2 两组细胞存活情况

在细胞注射治疗1周后，与对照组（MDSCs组）细胞存活数（87.67±1.53）个/每个高倍镜视野比较，治疗组（IGF1/MDSCs组）的细胞存活数（107.67±2.52）个/每个高倍镜视野显著高，差异有统计学意义（P<0.01），见图1。

2.3 两组大鼠近端尿道组织VEGF蛋白表达

在细胞注射治疗4周后，与对照组VEGF蛋白的表达（0.69±0.02）比较，治疗组（0.80±0.03）高，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。

注：A图为治疗组细胞存活情况（×200），B组为对照组细胞存活情况（×200）。

3 讨论

现有的治疗对伴有ISD的SUI患者充满挑战，细胞治疗为之提供了一个可能。研究发现MDSCs不经诱导可以分化为肌细胞，已成功应用于临床治疗SUI[8]。然而，植入的MDSCs由于机体局部缺血缺氧、氧化应激等不利因素致使植入的细胞存活率下降，进而影响细胞的移植效果。基因修饰的细胞治疗可以通过优化移植细胞微环境，提高细胞的活性，进而改善细胞的移植效果[9]。研究发现细胞移植治疗1周后，IGF1/MDSC组细胞在尿道注射部位分布比较集中，存活率显著高于MDSC组。提示IGF-1作为一促存活因子，可以优化移植微环境，提高植入MDSCs的存活率，进而促进MDSCs分化为成肌细胞，改善尿道括约肌闭合功能[10]。

骨骼肌損伤后的再生修复还应考虑局部血管的再生化。广泛的血管网可以促进局部血液循环，利于植入细胞的生存生长。研究发现细胞治疗4周后，IGF1/MDSC组尿道局部VEGF蛋白表达量明显高于MDSC组。提示IGF-1可以促进MDSCs分泌VEGF，而VEGF具有促进肌细胞生成及促进血管再生的双重作用，进而改善尿道括约肌闭合功能[11]。

在应力状态下，具有神经支配的尿道括约肌的收缩功能变化可以通过尿动力学中ALPP反映[12]，研究发现IGF1/MDSC组在治疗1、2、4周后ALPP均高于MDSC组，提示IGF-1可能促进尿道固有括约肌神经再支配，进而进一步改善尿道括约肌闭合功能。

IGF-1可以通过优化移植微环境，促进移植细胞的生存、生长，并通过其自分泌或旁分泌的形式释放VEGF，促进局部血液循环，共同参与尿道括约肌的成肌修复，进而改善尿道括约肌闭合功能，具有潜在治疗伴有ISD的SUI作用。

参考文献

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（收稿日期：2018-03-19）