复方阿胶浆对小鼠子宫内膜作用研究

丁桂清，魏华芳，王立群，朱楚超，王 晶*

(1.湖北中医药大学，武汉 430070； 2.中国人民解放军武汉总医院妇产科，武汉 430070)

复方阿胶浆是由阿胶、红参、熟地黄、党参、山楂所组成的中药复方制剂，具有补气养血之功效。近年来，由于该药服用方便且口感较好，已被广大患者所接受，并在贫血以及化疗后骨髓抑制、免疫力低下等疾病的治疗上取得了较好疗效[1-2]。同时，该药物在妇科疾病中的应用也逐渐增多，临床研究发现，其不但可以用于治疗女性月经不调[3-4]，而且可改善卵巢功能[5]，辅助促排卵治疗，并增加患者子宫内膜厚度，提高子宫内膜容受性[6]。然而，目前关于复方阿胶浆对子宫内膜功能方面影响的研究仍较少，我们仍然不清楚复方阿胶浆是否对子宫内膜有作用。本研究通过观察去势及假手术小鼠在复方阿胶浆灌胃后的子宫变化情况，探讨其对子宫内膜的作用及其可能的作用机制，旨在为临床用药提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级C57雌性小鼠50只，8～9周龄，体质量18～20 g，来源于湖北省疾控中心[SCXK (鄂) 2015-0018]。所有动物饲养于中国人民解放军武汉总医院医学实验科[SYXK (鄂) 2017-0065]，光照周期为12 h，室温(20±1)℃，自由饮食。通过阴道图片连续观察两个动情周期，取动情周期正常小鼠40只用于实验。

1.2 主要试剂与仪器

药物：复方阿胶浆，主要成分为：阿胶、红参、熟地黄、党参、山楂，规格：20 mL/支，山东东阿阿胶股份有限公司生产，国字准号：Z20083345。

VEGF-A抗体购自Abcam(ab1316)；β-actin抗体购自Proteintech(20536-1-AP)；小鼠IgG-免疫组化试剂盒购自武汉博士德；HRT标记羊抗鼠二抗购自Biosharp；DAB显色试剂盒购自北京索莱宝；BCA蛋白浓度定量试剂盒购自碧云天；PVDF膜购自美国Millipore。RM2016石蜡切片机：上海徕卡仪器有限公司；YD-6L生物组织包埋机：金华市益迪医疗设备有限公司；恒温培育箱：上海市跃进医疗器械厂；Olympus BX51光学显微镜照相系统：日本Olympus；RT-6500型酶标仪：美国Rayto公司；DYCZ-24DN型垂直电泳槽：北京六一仪器厂；DYCZ-40型电转仪：北京六一仪器厂；TS-1型水平摇床：江苏海门其林贝尔公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

实验动物随机分为4组：假手术组、假手术中药组、去势组及去势中药组，每组10只。

1.3.2 动物造模

去势小鼠予完整摘除双侧卵巢，首先用10%水合氯醛麻醉小鼠(0.4 mL/100 g)。使小鼠左侧卧位，消毒后自小鼠背部肋骨下靠脊柱处开口进入腹腔，用眼科镊找出卵巢并将其完整摘除后缝合皮肤，右侧同理，待小鼠自然苏醒。假手术组操作步骤同两去势组，但只剪去卵巢周围部分脂肪组织，不损伤卵巢。术后小鼠恢复3 d后行阴道涂片5 d，若两去势组小鼠动情周期消失，两假手术组动情周期正常即为造模成功。本实验已经由实验动物使用与管理委员会批准[伦理证号：20170239号]，动物饲养及处理按照实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。

1.3.3 给药方法

假手术中药组及去势中药组每天上午予复方阿胶浆灌胃，根据人和动物体表面积等效剂量换算[7]，以许文生氏公式计算人的体表面积，再以Meeh-Rubner氏公式计算小鼠体表面积，将168 cm/55 kg女性用药剂量换算为20 g小鼠得到0.25 mL/只，假手术组及去势组给予等量生理盐水，共计15 d。于第15天灌胃后，断颈处死小鼠，取出子宫，一部分用多聚甲醛固定后石蜡包埋，另一部分-80℃冻存。

1.3.4 HE染色

将厚度为4 μm的石蜡切片常规脱蜡至水，苏木素染色1.5 min，水洗，1%盐酸酒精分色10 s，自来水返蓝5 min，伊红染色10 s，无水乙醇终止反应，中性树胶封片，显微镜下观察各组子宫内膜形态学变化。

1.3.5 免疫组化

切片常规脱蜡至水，3% H2O210 min，柠檬酸抗原热修复5 min，自然冷却后重复一次，10%山羊血清37℃封闭30 min，一抗VEGF-A(1∶200)4℃过夜，二抗(1∶150)、SABC(1∶150)37℃，30 min，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。PBS代替一抗为阴性对照。显微镜拍照，采用图像分析系统分析实验结果。

1.3.6 Western blot

子宫组织提取蛋白后行蛋白浓度测定，统一蛋白浓度为6 μg/μL。使用SDS-PAGE电泳分离蛋白，每组上样量为6 μL。150 mA恒流转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗VEGF-A(1∶200)室温孵育1.5 h，HRT标记二抗(1∶2000)室温孵育2 h，洗膜后ECL发光液显色曝光。并以β-actin作为内参。测量各组VEGF-A的灰度值与β-actin比值后作为相对表达量进行对比。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 HE染色观察子宫内膜形态学变化

与假手术组相比，假手术中药组子宫增大，内膜增厚，子宫腺体数目多，腺腔大，间质水肿(图1A、1B)；去势组和去势中药组子宫结构完整，但均出现萎缩，与去势组相比，去势中药组子宫内膜略厚，腺体结构清楚，但差异不明显(图1C、1D)。

2.2 免疫组化观察复方阿胶浆对VEGF-A表达的影响

VEGF-A在子宫中主要表达于子宫内膜腔上皮和腺上皮细胞，间质细胞中表达较少。假手术中药组中VEGF-A的表达量显著高于假手术组(P< 0.05)；雌鼠去势后子宫内膜中VEGF-A的表达明显减少；去势中药组中VEGF-A的表达高于去势组，但差异无显著性。见图2、表1。

2.3 Western blot检测子宫VEGF-A蛋白表达量差异

将假手术组及假手术中药组子宫组织进行Western blot检测，以β-actin蛋白作为内参，比较两组间VEGF-A的蛋白表达量，结果如图3。结果显示：复方阿胶浆灌胃可显著上调假手术组子宫内膜VEGF-A的表达。

注：A：假手术组；B：假手术中药组；C：去势组；D：去势中药组。图1 各组子宫组织形态(HE染色，× 100)Note. A: Sham operation group; B: sham operation with Chinese medicine group; C: ovariectomized group; D: ovariectomized with Chinese medicine group.Figure 1 Uterine tissue morphology in each group. HE staining

组别Groups子宫内膜VEGF-A表达(OD值)VEGF-A expression in endometrium (OD value)假手术组Sham operation group0.30±0.03假手术中药组Sham operation with Chinese medicine group0.51±0.03*去势组Ovariectomized group0.20±0.01去势中药组Ovariectomized with Chinese medicine group0.21±0.02

注：与假手术组相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the sham operation group,*P< 0.05.

3 讨论

复方阿胶浆主要由阿胶、红参、熟地、党参、山楂等中药组成，为补益气血之良品。方中君药阿胶属“血肉有情之品”，与熟地配伍起补血滋阴之功效；红参大补元气，能益气生津，根据“气能生血”理论，气足则血亦旺。中医认为“肝主藏血”，而肝与肾“乙癸同源”，故气足血旺，则肾精充沛，冲任有养。因此，中医学者认为复方阿胶浆可用于治疗气血不足、肾气亏虚、冲任不调等一系列病症，推测其可用于调节“肾-天癸-冲任-胞宫”生殖轴的功能。现代研究亦发现补肾调冲任类中药能够起到调节生殖轴的作用[8]，例如改善卵巢功能、增加卵巢及子宫动脉血流、改善子宫内膜微环境等。

姚丽雯等[9]研究发现单用复方阿胶浆对患者体内激素水平的影响与单用克罗米芬无明显差异，且当二者合用时，可更有效地调节患者体内性激素水平，促进卵巢排卵。此外，有临床研究表明，复方阿胶浆可用于调节女性月经、治疗卵巢早衰[3-5]，说明复方阿胶浆可调节女性体内性激素的分泌，调节卵巢功能。本实验结果显示：复方阿胶浆对雌鼠子宫内膜形态有一定影响，其可促进假手术组雌鼠子宫内膜生长及腺体发育。而当雌鼠去势后卵巢缺失时，子宫出现萎缩，复方阿胶浆促进子宫内膜生长及腺体发育的作用效果并不显著。因此，我们推测复方阿胶浆可能是通过调节卵巢的内分泌功能从而间接影响子宫内膜的生长及腺体发育。

注：A：假手术组；B：假手术中药组；C：去势组；D：去势中药组。图2 各组小鼠子宫组织中VEGF-A的表达(× 400)Note. A: Sham operation group; B: sham operation with Chinese medicine group; C: ovariectomized group; D: ovariectomized with Chinese medicine group.Figure 2 The expression of VEGF-A in the uterine tissues in each group

注：与假手术组相比，* P< 0.05。图3 子宫VEGF-A蛋白表达量Western blot检测结果Note. Compared with the sham operation group,* P< 0.05.Figure 3 Western blot results of VEGF-A protein expression in uterus

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族是一系列参与血管再生的糖蛋白，目前人们在哺乳动物中发现的主要包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及胎盘生长因子。其中VEGF-A为一种特异性的促血管内皮细胞丝裂原，具有促进血管内皮细胞分裂、增生、诱导血管产生及改善血管通透性等作用[10]。VEGF-A的表达异常常导致许多与血管新生相关疾病的发生，如肿瘤、视网膜病变、肾脏病变、子宫内膜异位症等[11-12]。同时，VEGF-A与女性生殖系统关系密切，其表达于女性子宫内膜，并随月经周期发生周期性变化。国内外实验均发现在实验动物行卵巢切除术后，子宫内膜中VEGF-A的表达量明显减少[13-14]。此次实验中，我们亦发现小鼠去势后，子宫出现萎缩，且子宫内膜中VEGF-A的表达量也明显减少，这与之前的研究结果相一致[13-14]，证明卵巢可调节子宫内膜中VEGF-A的表达水平。由于雌、孕激素可以使子宫内膜细胞分泌的VEGF-A水平增加[15]，Huang等[16]亦通过实验证明了雌激素能够诱导子宫内膜中VEGF-A的迁移及表达，说明VEGF-A的表达受雌、孕激素的调节。此次实验中我们发现复方阿胶浆灌胃使假手术组小鼠子宫内膜中VEGF-A的表达上升，但并未对去势小鼠子宫内膜中VEGF-A的表达量产生明显影响，因此，我们猜想：复方阿胶浆可能通过调节卵巢雌、孕激素的分泌，进而影响子宫内膜中VEGF-A的表达，影响子宫内膜的功能。

在女性妊娠过程中VEGF-A起着至关重要的作用[17]，当处于种植窗口期时，子宫内膜中的VEGF-A表达量明显增多，其可通过调节子宫内膜微环境而促进胚胎植入[18]，而当其缺失时，胚胎无法完成成功植入。在辅助生殖的相关研究中发现，促排卵后子宫内膜中VEGF-A表达较正常子宫明显减少，VEGF-A表达的减少也被认为是影响胚胎植入的因素之一[19]，近年来VEGF-A已被许多学者视为评价子宫内膜容受性的指标之一。因此次研究中我们发现复方阿胶浆可增加子宫内膜厚度及子宫内膜中VEGF-A的表达量，故推测其可通过调节子宫内膜环境而改善子宫内膜容受性。近年来，辅助生殖技术虽在不断发展，但临床妊娠率仍未满足患者期望，许多育龄期妇女因排卵障碍、卵巢早衰、子宫内膜容受性差等原因而不能成功妊娠，复方阿胶浆作为一种中药复方之剂，其无明显副作用，且可调节女性生殖内分泌轴，调节卵巢功能，改善子宫内膜容受性，或可成为临床辅助不孕症治疗的新选择。

总之，通过此次实验，我们发现复方阿胶浆对子宫内膜形态学及微环境确实存在一定影响，其可能是通过调节卵巢功能而间接作用于子宫，但有关其对卵巢的作用及作用机制，是否能够直接影响卵巢雌、孕激素的分泌，还有待进一步研究。