Box—Behnken响应面法优化青龙衣中胡桃醌提取工艺

王丽红 闫勇杰 赵宏 宗希明 张云杰

摘要：目的 对青龙衣中胡桃醌的提取工艺进行优化。方法 在单因素试验基础上，选取料液比、超声提取温度和乙醇浓度为自变量，胡桃醌得率为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理，采用响应面法对青龙衣中胡桃醌的提取工艺进行优化。结果 胡桃醌最佳提取工艺为14.30倍量89.81%乙醇，30.28 ℃恒温提取。胡桃醌得率为2.034 mg/g，与实测值1.957 mg/g偏差较小。结论 优选的提取工艺合理可行，可为提取青龙衣中的胡桃醌提供依据。

关键词：青龙衣；Box-Behnken响应面法；核桃楸；胡桃醌；提取工艺

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.016

中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）07-0067-04

Abstract： Objective To optimize extraction process of walnut quinone from Juglans green peel. Methods On the basis of single factor tests， taking material-liquid ratio， extracting temperature and ethanol concentration as independent variables， yield of walnut quinone in response to as a value， according to Box-Behnken experiment design principle， extraction process of walnut quinone from Juglans green peel was optimized by response surface analysis. Results The optimum extraction process of walnut quinone was： 14.30 times the amount of 89.81% ethanol； 30.28 ℃ constant temperature. The extracting amount of walnut quinone was 2.034 mg/g， which was close to the experimental results of 1.957 mg/g. Conclusion The optimized extraction process is reasonable and feasible， which can provide reference for the extraction of walnut quinone from Juglans green peel.

Keywords： Juglans green peel； Box-Behnken response surface methodology； Juglans mandshurica； walnut quinone； extraction process

核桃楸Juglans mandshurica Maxim.又名胡桃楸，为胡桃科胡桃属落叶乔木，是我国珍贵木材树种[1]。核桃楸树皮、枝皮和果皮均可入药，其未成熟外果皮又称青龙衣。《中华本草》记载青龙衣“氣微，味微苦、涩。清热燥湿，泄肝明目。主治湿热下痢，带下黄稠，目赤肿痛，麦粒肿，迎风流泪，骨结核”[2]。青龙衣具有清热、解毒、镇痛、抗肿瘤等功效[3]，主要含有多糖类、醌类、黄酮类及大量鞣质等化学成分，胡桃醌为青龙衣抗肿瘤的主要成分。1973年，Ota A等[4]从野核桃新鲜青皮中分离提纯出5，8-二羟基-l，4萘醌，得出青龙衣中存在萘醌的结论，至今萘醌及其衍生物已成为各地学者的研究重点[5]。

国内已有学者采用HPLC和紫外分光光度法对核桃楸青果皮、树皮和树叶中胡桃醌提取工艺进行研究，试验方法均为单因素和正交试验[6-9]。由于未对单因素选择进行优化且考察因素较少、正交试验只能处理离散型数据等缺陷，得出的提取工艺中各因素水平数值不够精确。本研究在单因素试验优化基础上，通过Box-Behnken响应面分析法优选青龙衣中胡桃醌的最优提取工艺。

1 仪器与试药

Agilent 1100 Series HPLC色谱仪（美国安捷伦公司），BP211D型电子天平（德国赛多利斯公司），FA2004电子分析天平（上海恒平科学仪器有限公司），KQ-250DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），80-2台式低速离心机（上海亚荣生化仪器厂），SHB-III循环水式多用真空泵（郑州世纪双科实验仪器有限公司）。

胡桃醌对照品（纯度≥98%，河南省标物生物科技有限公司，批号16081201），色谱纯甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司），其余试剂均为分析纯。

试验用材料于2016年9月21日采自黑龙江省汤原县鹰山，经佳木斯大学王丽红教授鉴定为胡桃科胡桃属核桃楸Juglans mandshurica Maxim.的果实，果皮剥下后阴干[10]，粉碎后过孔径0.25 mm网筛，备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 测定波长

取胡桃醌对照品溶液适量，用紫外分光光度计在波长0～800 nm扫描，得248 nm为胡桃醌紫外最大吸收波长，故选择该波长为测定波长。

2.1.2 分离条件

依据文献[11]，HPLC测定胡桃醌含量时，流动相为甲醇-水（55∶45）且水相用磷酸（约0.1%）调pH值为3.30～3.80时胡桃醌分离峰形最佳。

2.1.3 色谱条件的确定

采用Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（55∶45），水相用磷酸（约0.1%）调pH值为3.60，流速为1 mL/min，检测波长248 nm，柱温为室温，进样量10 μL[12]。色谱图见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

准确称取胡桃醌对照品5.09 mg，用甲醇定容到25 mL容量瓶中，得胡桃醌对照品母液。精密移取该对照品母液0.25、0.5、1.25、2.5、5、10 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得浓度分别为5.09、10.18、25.45、50.9、101.8、203.6 μg/mL的对照品溶液。进样前用0.45 μm微孔膜过滤，取滤液进行HPLC分析[13]。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密称取青龙衣粉末2.00 g，置于100 mL锥形瓶中，加无水乙醇30 mL，25 ℃超声提取40 min，过滤，3500 r/min离心15 min，取上清液定容到10 mL容量瓶中。进样前用0.45 μm微孔膜过滤，取滤液进行HPLC分析。

2.2.3 标准曲线的绘制

依次取“2.2.1”项下对照品溶液各10 μL进样，以胡桃醌浓度为横坐标，峰面积为縱坐标，绘制标准曲线，得到回归方程Y=38.10X-172.6，r=0.999 5，表明胡桃醌在5.09～203.6 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。

2.3 精密度试验

取低、中、高浓度（23.11、42.98、124.87 μg/mL）样品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件连续进样5次，结果RSD分别为1.52%、1.79%、1.34%。

2.4 稳定性试验

将供试品溶液在一定时间内按上述色谱条件进样，测定胡桃醌含量。结果室温放置12 h内检测，胡桃醌含量稳定；12～24 h检测，胡桃醌含量略有下降；2 d后检测，胡桃醌分解。

2.5 重复性试验

取同一次采集的青龙衣，按上述方法制备5份供试品溶液，按上述色谱条件重复进样，测定胡桃醌含量。结果胡桃醌平均含量为0.16%，RSD=1.53%。

2.6 加样回收率试验

精密量取已知含量供试品溶液6份，每份4 mL，分别置于10 mL容量瓶中，依次加入1、2、3、4、5、6 mL对照品溶液（浓度20 μg/mL），并用无水乙醇分别定容至刻度，按上述色谱条件进样测定。结果平均回收率为96.74%，RSD=1.73%。

2.7 单因素试验考察

精密称取青龙衣粉末2.00 g，通过单因素试验，考察超声提取时间（10～40 min）、提取温度（20～35 ℃）、料液比（1∶10～1∶20）、乙醇浓度（80%～100%）对胡桃醌得率的影响。

2.7.1 提取时间

设定提取温度30 ℃、料液比1∶15、乙醇浓度100%，考察提取时间10、20、30、40、50 min对胡桃醌得率的影响，结果依次为1.526、1.695、1.848、1.930、1.924 mg/g。表明胡桃醌得率呈先升高后降低趋势，且在40 min达到最大，故提取时间以40 min为宜。

2.7.2 提取温度

设定提取时间40 min、料液比1∶15、乙醇浓度100%，考察提取温度20、25、30、35 ℃对胡桃醌得率的影响，结果依次为1.617、1.689、1.943、1.821 mg/g。表明胡桃醌得率呈先升高后降低趋势，且在30 ℃达到最大，故提取温度以30 ℃为宜。

2.7.3 料液比

设定提取时间40 min、提取温度30 ℃、乙醇浓度100 %，考察料液比1∶10、1∶15、1∶20对胡桃醌得率的影响，结果依次为1.460、1.644、1.580 mg/g。表明胡桃醌得率呈现先升高后降低趋势，且在料液比为1∶15达到最大，故料液比以1∶15为宜。

2.7.4 乙醇体积分数

设定提取时间40 min、提取温度30 ℃、料液比1∶15，考察乙醇浓度80%、90%、95%、100%对胡桃醌得率的影响，结果依次为1.388、1.613、1.849、1.684 mg/g。表明胡桃醌得率呈先升高后降低趋势，且乙醇浓度为95%最大，故乙醇浓度以95%为宜。

2.8 响应面法优化试验

在单因素试验考察基础上，根据Box-Behnken试验组合原理，选取料液比、提取温度、乙醇浓度为自变量，胡桃醌得率为响应值，采用Design-Expert7.1.3软件设计试验方案，因素水平见表1，试验安排及结果见表2。

采用Design-Expert7.1.3软件对胡桃醌提取工艺各因素进行回归拟合，得回归方程Y=2.02-0.12A+0.033B-0.003 125C+0.021AB+0.039AC+0.062BC-0.44A2-0.25B2-0.13C2，该模型的方差分析见表3。结果表明建立的回归方程有统计学意义，模型R2=0.818 1，r=0.904 5，模型拟合度较好，试验误差小，可用此模型对青龙衣中胡桃醌的提取工艺进行预测分析，因素A、A2、B2和C2对胡桃醌得率有极显著影响，因素B、C影响不显著，交互项AB、AC、BC影响不显著。

采用Design-Expert7.1.3软件，根据拟合模型绘制青龙衣中胡桃醌含量响应面的等高线图与响应面图，可得到各参数范围内的极值及因素间相互作用对响应值的影响，见图2。结果显示，该回归方程存在极大值，最大响应值为2.034 mg/g。此时最优工艺条件为：料液比1∶14.30，乙醇浓度89.81%，提取温度30.28 ℃。结合生产实际考虑，将最佳提取工艺调整为提取时间40 min，提取温度30.50 ℃，乙醇浓度89.80%，料液比1∶14.30。

2.9 验证试验

精密称取青龙衣粉末3份，每份2 g，按优选的提取工艺条件进行验证试验，结果胡桃醌平均得率为1.957 mg/g，与理论预测值相差较小，说明采用响应面法对青龙衣中胡桃醌的提取工艺进行参数优化结果准确可靠。

3 讨论

我国地域辽阔，核桃楸树种分布繁多，青龙衣资源丰富。研究发现，青龙衣治疗胃痛及抗肿瘤等作用显著，胡桃醌为其主要有效成分[14-15]。但胡桃醌不稳定，易分解、挥发的特点使其开发利用受到限制。随着研究不断深入，胡桃醌的提取工艺得到优化。

本试验中，因超声提取机械产热会使水温稍有升高，为防止胡桃醌受热分解、挥发造成误差，需不断换水以保持水温恒定。进行HPLC含量测定时，需平行进针以保证数据的可靠性。

在提取工艺方面，Box-Behnken响应面分析法可克服正交试验只能处理离散型数据的缺陷，可连续对整个区域的各个水平进行分析，极大程度优化提取工艺。本研究在单因素试验基础上，通過对优选的料液比、提取温度、乙醇浓度各水平的多元回归及二项拟合，建立胡桃醌得率与各因素的回归方程，得出料液比、提取温度及乙醇浓度的平方项对胡桃醌得率影响显著，并最终确定了最佳提取工艺，为青龙衣的资源化利用提供了参考依据。

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（收稿日期：2017-09-19）

（修回日期：2017-11-13；编辑：陈静）