猪胸膜肺炎放线杆菌ftsW基因的克隆和分析

2018-09-22陈尔曼邓宗云郭慧芝黄复深黄亚斌

畜牧兽医科技信息 2018年9期

陈尔曼，邓宗云，郭慧芝，黄复深，黄亚斌

（1.湖南省株洲市动物卫生监督所，湖南株洲 412000；2.珠江水产研究所，广东广州 510145；3.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128；4.湖南省醴陵市畜牧兽医水产局，湖南醴陵 412200）

猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌引起的一种高度传染性疾病。该病急性型死亡率可达100%,常表现为急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎。近些年来，随着养猪集约化程度提高，猪群引种频繁，导致该病的发病情况更加复杂，常呈混合感染，包括多种致病细菌、病毒性和寄生虫病原在内的混合感染，混合感染使该病及其它猪病的防制难度增大，经济损失巨大。

Pattison等1957年首次报道了该病。迄今为止，已证实本病世界范围内有广泛流行，包括欧洲、美洲、非洲、澳洲、东南亚等地区。流行的主要血清型有血清1、2、5、7型，其中血清2型主要流行于欧洲国家，其他血清型主要在北美地区流行。1987年，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所首次确诊猪传染性胸膜肺炎临床病例，证实了我国存在猪传染性胸膜肺炎。目前我国二十多个省、市、自治区相继分离出猪传染性胸膜肺炎细菌，研究表明，我国流行的主要是血清 1、3、4、5、7型，主要以血清7型为主，其次为血清2、4、5、10型。

猪传染性胸膜肺炎的防治以药物为主，免疫预防主要采用灭活苗，但免疫保护谱窄，不能产生交叉免疫保护。亚单位疫苗主要集中在其毒力因子，但其最大的缺点是免疫保护效果差，临床应用意义不大，因此有必要寻找新的疫苗候选分子。同时由于长期用药抗药性产生的可能性。因此筛选一些新的疫苗候选分子及药物靶点非常重要,为此进行了本研究。

1 材料和方法

1.1 菌株、载体及主要试剂

1.1.1 菌种和培养基猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型来自湖南农业大学实验室保存。胰蛋白大豆肉汤培养基（TSB）从青岛日水生物技术有限公司购买。无支原体超级新生牛血清从杭州四季青生物工程材料有限公司购买。NAD氧化型辅酶Ⅰ从北京鼎国生物技术有限公司购买。

1.1.2 主要试剂PCR反应用试剂（2×Taq PCR Master Mix）、DNA标准分子量（D2000 Maker）从北京天根生化科技有限公司购买。

1.2 实验方法

1.2.1 猪胸膜肺炎放线杆菌ftsW基因的扩增根据Gen-Bank中已收录的App基因组序列中的ftsW基因序列,应用软件进行引物设计，设计ftsW外引物一对。PF 5'AAAGCGTATTGGTGGAGAC 3'，PR 5'CGCCTGCCA TRACAAGAAGT 3'。引物送上海生物工程公司合成。

按文献方法提取猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型基因组DNA。以猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型基因组DNA为模板，PCR扩增App ftsW基因。PCR扩增反应条件：95℃预变性5min,94℃变性50sec,55℃退火30sec，72℃延伸45sec，共30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，确证后送上海生物工程公司测序。

1.2.2 ftsW的序列分析序列的ORF（open reading frame,ORF）采用ORF finder分析。跨膜区采用TMHMM软件，二级结构采用SOPMA分析，功能区采用Pfam软件进行。在线应用blast软件找出猪胸膜肺炎放线杆菌不同血清型的FtsW蛋白相关的序列，用临接法（NJ）绘制基因进化树分析，并用Megalign软件对不同血清型的蛋白质序列进行相似性分析。

2 结果

2.1 APP ftsW目的基因扩增

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清型3的基因组为模板，PCR扩增目的基因ftsW。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳,可见一条大约1200bps左右的特异扩增产物条带,即获得约1200bp的基因片段，与预期的结果一致（图1）。ORF分析表明，该基因全长609bp，含一个完整开放阅读框，起始密码子为ATG，终止密子为TTT，编码201个氨基酸。

图 1 ftsW基因PCR扩增电泳图

2.2 猪胸膜肺炎放线杆菌ftsW的结构和功能分析

应用TMHMM软件和SOPMA软件进行分析发现，该编码蛋白为一跨膜蛋白，有6个跨膜区（图2）。其二级结构预测具有α-螺旋区、β-折叠区和无规卷曲4个二级结构类型，其中α-螺旋区占二级结构的76.2%，β-折叠占二级结构的84.2%，无规卷曲占7.4%。HAMAP在线分析表明，该基因编码的蛋白为肽聚糖糖基转移酶（Fts W）。

2.3 APP不同血清型ftsW的蛋白质序列比对分析

利用DNAMAN对APP不同血清型ftsW氨基酸序列进行比对分析显示：从已报道的ftsW序列比对发现来源不同血清型的ftsW序列具有100%的同源性（图3）。

3 讨论

本研究从App基因组中扩增了一个App ftsW基因。该基因全长606bp，含有一个开放阅读框(ORF)，起始密码子为ATG，终止密子为TTT，编码201个氨基酸。为一跨膜蛋白。功能分析发现其为肽聚糖糖基转移酶（FtsW）。

图3 APP不同血清型ftsW的蛋白质序列比对分析

图 2 App ftsW跨膜区分析

大肠杆菌的研究表明肽聚糖糖基转移酶是细菌的细胞分裂时细胞壁的延伸所必须,同时还参与细菌细胞形状的维持作用。研究发现有一类对热敏感的相关基因fts(filamentou temperature sensitive，fts)参与了细菌的细菌细胞分裂过程。Fts突变体表现为分裂活动随外界环境的温度升高时而出现短暂的停滞,同时可见不分裂的长丝状菌体；但是外界生长温度适宜时，细菌分裂活动又能恢复正常的活动。研究表明，在细菌进行分裂前,首先需要形成一个分裂复合体，该复合体体由多个分裂相关蛋白组成。FtsZ是一种微管蛋白。细菌分裂时ftsZ在分裂位点上组装成一个环状结构，称为Z-环。分裂复合体的其它蛋白附着在Z-环上形成细胞分裂的结构。Z-环形成后，待分裂细胞形成分裂隔膜，进一步分裂成两个细胞。FtsW对Z-环的稳定性起重要作用。由于App FtsW的高度保守性膜蛋白及其重要功能，因此其可能作为未来研究疫苗和药物的对象。