紫外-可见分光光度法测定沙棘叶总黄酮含量的优化试验

2018-09-21梁爱军

山西林业科技 2018年3期

梁爱军

(1.山西省林业科学研究院，山西太原 030012;2.国家林业局沙棘工程技术研究中心，山西太原 030012))

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)，胡颓子科沙棘属落叶灌木，由于其耐旱、抗风沙的特性，被广泛应用于水土保持造林中。沙棘是一种重要的药食同源植物，其根、叶、花、果实、种子中含有黄酮、原花青素、维生素等多种营养成分，特别是沙棘叶中的黄酮类物质远大于其它部位，被广泛应用于食品、医药、化妆品等多个领域。现代医学表明，沙棘黄酮具有抑制动脉粥样硬化、降低血脂胆固醇水平、延缓衰老等作用。沙棘叶总黄酮的测定方法主要有分光光度法与高效液相色谱法。高效液相色谱法主要用于测定黄酮单体成分，具有精确度高、误差小的优点，但操作复杂、检测成本较高。分光光度法主要用于测定总黄酮含量，一般采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH为显色体系，但对于NaNO2，Al(NO3)3，NaOH的加入量与显色时间的文献报道均不一致。因此，笔者对沙棘叶样品溶液中总黄酮含量进行分析比较，以期建立最优的测定沙棘叶总黄酮含量的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

沙棘叶采自山西省关帝林局龙兴林场(5月至10月混合)；芦丁、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等试剂皆为市售国产分析纯。

仪器有电子天平(青岛紫泉仪器有限公司)，鼓风干燥箱(上海博讯有限公司)，电热恒温水浴锅(上海博讯有限公司)，紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，台式离心机(赛欧斯天津科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理

将沙棘叶于60 ℃鼓风干燥箱中干燥6 h，粉碎机粉碎，过80目筛后备用。

1.2.2 样品溶液的制备

精确称取5 g沙棘叶粉末，加60%乙醇50 mL，水浴加热2 h，离心过滤，定容至100 mL容量瓶中。之后再从容量瓶中取25 mL液体定容到50 mL容量瓶中备用。

1.2.3 空白参比的选择

将样品溶液、5%NaNO2溶液、10%Al(NO3)3溶液、4% NaOH溶液以不同组合方式，用30%乙醇定容至25 mL容量瓶中，于510 nm处测定吸光度值。

1.2.4 稀释定容乙醇浓度的选择

精确吸取1 mL样品溶液于25 mL容量瓶中，分别用30%，40%，50%，60%，70%乙醇定容，于510 nm处测定吸光度值。

1.2.5 显色剂加入量的选择

精确吸取1 mL样品溶液于25 mL容量瓶中，每次只改变一个剂量因素，用30%乙醇定容，于510 nm处测定吸光度值。

1)加入4%NaNO2溶液0.3 mL，0.5 mL，0.7 mL，1.0 mL，10%Al(NO3)3溶液1 mL，4%NaOH溶液10 mL.

2)加入4%NaNO2溶液1 mL，10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，0.5 mL，0.7 mL，1.0 mL，4%NaOH溶液10 mL.

3)加入4%NaNO2溶液1 mL，10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，4%NaOH溶液4 mL，6 mL，8 mL，10 mL.

1.2.6 显色时间的选择

精确吸取1 mL样品溶液于25 mL容量瓶中，每次只改变一个静置时间因素，用30%乙醇定容，于510 nm处测定吸光度值。

1)加入4% NaNO2溶液1 mL，静置2 min，4 min，6 min，8 min，10 min；10% Al(NO3)3溶液1 mL，静置6 min；4% NaOH溶液10 mL，静置15 min.

2)加入4% NaNO2溶液1 mL，静置6 min；10% Al(NO3)3溶液1 mL，静置2 min，4 min，6 min，8 min，10 min；4% NaOH溶液10 mL，静置15 min.

3)加入4% NaNO2溶液1 mL，静置6 min；10% Al(NO3)3溶液1 mL，静置6 min；4%NaOH溶液10 mL，静置5 min，10 min，15 min，20 min，25 min.

1.2.7 标准曲线的制作

配置0.2 mg/mL芦丁标准溶液，分别吸取0 mL，1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6 mL.之后加入5%NaNO2溶液1 mL，摇匀静置6 min.再加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀静置6 min.再加4%NaOH溶液10 mL，用30%乙醇定容至刻度，摇匀静置15 min，于510 nm处测定吸光度。以X轴为芦丁浓度，Y轴为吸光度，制作标准曲线。

1.2.8 沙棘叶总黄酮的计算

式中：w——沙棘叶总黄酮含量，mg/g；

c——根据标准曲线计算的沙棘叶总黄酮浓度，mg/mL；

v——提取液总体积，mL；

d——稀释倍数；

m——沙棘叶粉末质量，g.

2 结果与分析

2.1 空白参比的选择

不同空白参比的吸光度见图1.

图1 不同空白参比的吸光度

由图1可以看出，试剂空白亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠组(B+C+D)的吸光度值最低。由于样品本身有颜色，试剂空白不能排除样品中色素及一些其它有色杂质的吸光度，会导致结果偏高。样品溶液-亚硝酸钠组(A+B)、样品溶液-硝酸铝组(A+C)的吸光度稍大于样品溶液组(A)的吸光度，表明单独加入亚硝酸钠或硝酸铝与样品溶液中的少部分黄酮类物质发生反应。样品溶液-亚硝酸钠-硝酸铝组(A+B+C)的吸光度与样品测定(A+B+C+D)的吸光度基本接近，表明同时加入亚硝酸钠与硝酸铝与样品溶液中的大部分黄酮类物质发生络合反应。因此，选择样品溶液组(A)作为空白参比较好。

2.2 稀释定容乙醇浓度的选择

不同稀释定容乙醇浓度的吸光度值见图2.

图2 稀释定容不同乙醇浓度的吸光度

由图2可知，用30%，40%，50%，60%乙醇定容的吸光度值基本相近，因此乙醇浓度对该方法的最终显色影响不是很大。用70%乙醇定容的吸光度值稍高一些，可以选用70%乙醇稀释定容。

2.3 显色剂加入量的选择

显色剂加入量对吸光度值的影响见表1.

表1 显色剂加入量对吸光度值的影响

由表1可以看出，显色剂NaNO2，Al(NO3)3，NaOH的不同加入量对吸光度值的影响不显著，说明显色剂加入量的多少不影响吸光度值。为了节约试剂，选择NaNO20.3 mL，Al(NO3)30.3 mL，NaOH 4 mL.

2.4 显色时间的选择

显色剂显色时间对吸光度值的影响见表2.

表2 显色剂显色时间对吸光度值的影响

由表2可知，NaNO2静置时间对试验结果基本无影响，所以加入NaNO2后可直接加入Al(NO3)3，不必再摇匀静置。加入Al(NO3)36 min后，吸光度值趋于稳定，说明Al(NO3)3与黄酮类化合物的络合反应至少需要6 min才能完成。加入NaOH 10 min～15 min吸光度值基本没变化，静置25 min吸光度值减小。因此，加入NaOH后摇匀静置10 min即可，最长静置20 min.

2.5 标准曲线的制作

通过测定芦丁标准溶液的吸光度值，绘制芦丁标准曲线，见图3.

图3 芦丁标准曲线

2.6 沙棘叶总黄酮含量的测定

在上述得出的最优条件下进行3次平行测定，取1 mL样液于25 mL容量瓶中，加入5% NaNO20.3 mL，加入10% Al(NO3)30.3 mL，摇匀静置6 min.然后加入4% NaOH 4 mL，摇匀静置10 min，用70%乙醇定容至刻度。以只加样品溶液为空白参比，于510 nm处测定吸光度值，得到沙棘叶总黄酮提取率为1.94%，1.99%，2.10%，平均提取率为2.01%.