荧光分光光度法测定饲料中二氢吡啶的含量

◎ 戎筱卿

（苏州卫生职业技术学院，江苏 苏州 215009）

二氢吡啶是一种非营养性饲料添加剂，现已取代瘦肉精成为国内最常使用的饲料添加剂[1]。研究表明，二氢吡啶具有促进猪、鸡、牛、羊、鱼的生长，改善畜禽和鱼产品品质，提高猪、牛、羊、兔的繁殖性能及防病多种功能。所以，有必要对饲料中的二氢吡啶的含量加以控制。目前，测定饲料中二氢吡啶含量的方法主要有紫外分光光度法、高效液相色谱法等[2]。但紫外分光光度法灵敏度低，特异性低，检测结果不准确；高效液相色谱法操作繁琐，分析时间长，不利于快速分析[3]。二氢吡啶天然具有荧光，但目前尚未利用荧光分光光度法测定二氢吡啶的含量[4]。所以，本实验拟采用荧光分光光度法建立饲料中二氢吡啶含量的测定方法，并运用于质量控制[5]。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

RF-5301PC型荧光分光光度计，岛津-GL通用仪器有限责任公司；KQ-300DA型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；电子天平XS205，Mettler Toledo。

二氢吡啶对照品，中国药品生物制品检定研究院，批号170322，纯度为99.0%；氢氧化钠、磷酸、甲酸，均为分析纯；饲料从多个兽药店采集，水为蒸馏水。

1.2 溶液的制备

1.2.1 对照品溶液

精密称取二氢吡啶对照品15.20 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，加1%磷酸乙腈适量超声溶解，定容至刻度，作为对照品储备溶液。精密移取储备液1 mL置于100 mL棕色容量瓶中，加1%磷酸乙腈定容至刻度，即得浓度约为1 μg/mL的对照品使用溶液[6]。

1.2.2 供试品溶液

取饲料100 g研细，混合均匀，精确称取10 g，置于100 mL棕色容量瓶中，加入1%磷酸乙腈溶液60 mL，0 ℃水浴超声20 min，取出，用1%磷酸乙腈溶液定容至刻度，摇匀。13 000 r/min离心5 min，移取上清液1 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，加入1%磷酸乙腈溶液定容至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，即得。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

准确移取1.2.1中制得的对照品使用溶液0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 mL，分别置于10 mL棕色容量瓶中，加入1%磷酸乙腈溶液稀释至刻度，摇匀，得到浓度依次为 0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 µg/mL对照品溶液（L1-L5）。以1%磷酸乙腈溶液为空白溶剂，在Ex 363 nm、Em 448 nm下测定其吸光度[7]。以吸光度A为纵坐标、浓度c为横坐标绘制曲线，计算回归方程为A=545.9c+54.8，r=0.997 0。结果表明，二氢吡啶在0.05～1.00 µg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。

2.2 测定波长的选择

准确移取1.2.1中制得的二氢吡啶对照品使用溶液适量，以1%磷酸乙腈溶液为空白溶剂，将对照品溶液在激发波长220～400 nm、发射波长400～600 nm进行扫描，结果如图1所示。由图1可知，其最大激发波长为363 nm，最大发射波长为448 nm。

图1 二氢吡啶乙腈溶液的激发、发射光谱图

2.3 空白溶液的紫外光谱

配制1%磷酸乙腈溶液，按2.2项测定，结果如图2所示。由图可知，空白溶剂在最大激发波长363 nm、最大发射波长为448 nm处无明显吸收。

图2 1%磷酸乙腈溶液的激发、发射光谱图

2.4 精密度实验

移取2.1项下二氢吡啶对照品溶液L3适量，于Ex 233 nm、Em 464 nm下测定吸光度，重复6次，测得荧光强度，计算得RSD为0.61%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性实验

精确称取2号饲料10 g，6份，置于100 mL棕色容量瓶中，按1.2.2中的供试品溶液的制备项处理，测定，计算含量，结果6份测定值RSD为3.75%。

表1 重复性实验表

2.6 检测限

取1%磷酸乙腈溶液适量，在Ex 233 nm、Em 464 nm下测定荧光强度，重复11次，计算SD。按公式（1）计算该方法的检测限。

式（1）中，k为标曲的斜率。计算得检测限LOD为 0.013 μg/mL。

2.7 稳定性考察

精确称取2号饲料10 g，3份，置于100 mL棕色容量瓶中，按1.2.2中的供试品溶液的制备项处理，分别于0m、20、40、60、120 min测定其荧光强度，计算RSD[8]。结果发现均小于2%，说明该对照品溶液2 h内基本稳定，不影响含量测定。

2.8 回收率实验

精确称取2号饲料5 g，6份，置于100 mL棕色容量瓶中，再分别加入二氢吡啶对照品储备溶液0.5 mL，按1.2.2中的供试品溶液的制备项处理，测定其荧光强度，计算回收率，结果见表2。

表2 回收率试验表

2.9 样品测定

移取1.2.2项下供试品溶液适量，以1%磷酸乙腈溶液为空白溶剂，在Ex 233 nm、Em 464 nm下测定荧光强度，重复测定3次，取平均值，计算其含量，结果见表3。

表3 含量测定表

3 结果与讨论

3.1 提取溶剂的选择

二氢吡啶微溶于水，能溶于热乙醇、乙腈[9]。所以，本实验选择乙腈为提取溶剂[10]。本实验考察了二氢吡啶的1%甲酸乙腈、1%磷酸乙腈、1%氢氧化钠乙腈溶液的荧光强度，发现：1%甲酸乙腈会导致荧光淬灭，1%磷酸乙腈和1%氢氧化钠乙腈溶液的荧光强度接近。考虑到化合物的稳定性，最终采用1%磷酸乙腈作为样品提取溶剂。

3.2 检测波长的确定

本实验分别扫描了二氢吡啶1%磷酸乙腈溶液及空白溶剂的荧光激发和发射光谱，二氢吡啶的最大紫外吸收波长为230 nm、363 nm处，最大发射波长为448 nm。考虑溶剂干扰，确定了最大激发波长为363 nm、发射波长448 nm，作为定量测定波长。

3.3 方法的优势

二氢吡啶作为普遍使用的饲料添加剂，一般的添加比例为0.01%～0.02%，现有测定方法主要是紫外分光光度法，灵敏度低，难以满足饲料的测定要求[11]。二氢吡啶天然具有荧光，利用荧光分光光度法测定可以取得更低的检测限，达到检测饲料中微量添加二氢吡啶的要求。

4 结语

采用荧光分光光度法测定饲料中二氢吡啶的含量，方法简便快捷，数据可靠准确，可作为饲料中二氢吡啶含量的测定方法。