渤海黑牛Y染色体遗传多样性及父系起源研究

常振华，侯佳雯，宋恩亮，成海建，陈 宏，雷初朝*

(1.渭南职业技术学院，陕西渭南 714000；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100；3.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南 250100)

渤海黑牛原称"无棣黑牛"，又称"抓地虎牛"，原产于山东省滨州市，中心产区包括无棣县、沾化县、阳信县和滨城区，在山东省的东营、德州、潍坊三市和河北沧州市均有分布。它具有早熟、繁殖性能好、屠宰率高、耐粗饲、抗逆性强、肉质大理石纹明显、遗传性能稳定等优点，是我国少有的黑色毛色地方良种牛资源[1]。在分子水平上，王建英等[2]通过对渤海黑牛和日本和牛线粒体DNA遗传多样性分析，发现二者亲缘关系较近，渤海黑牛含有欧洲型原牛和瘤牛型原牛的血统；周芬娜等[3]利用RAPD标记检测鲁西黄牛和渤海黑牛遗传多样性，结果显示渤海黑牛的遗传多样性显著低于鲁西牛；任艳玲等[4]通过分析渤海黑牛mtDNA Cytb基因遗传多样性，发现其遗传多样性较丰富。

Y染色体遵循父系遗传，具有突变率低，单倍型完整，不易受重组和回复突变等因素影响等优点，是探究家畜父系遗传多样性、起源和进化的重要工具[5]。Götherström等[6]利用5个Y-SNPs标记将黄牛Y染色体单倍型组分为普通牛Y1、Y2和瘤牛Y3单倍型组；Edwards等[7]发现牛的4个Y-STRs位点可以区分普通牛和瘤牛起源，可以用来研究杂交牛的基因渐渗情况；Li等[8]利用4个Y-SNPs标记和2个Y-STRs标记对16个中国黄牛品种进行多态性分析，发现中国黄牛主要存在普通牛Y2和瘤牛Y3 2个父系起源，并且各品种的Y染色体单倍型组呈现出清晰的地理分布规律。迄今为止，关于渤海黑牛Y染色体遗传多样性的研究较少[8]。本研究利用2个Y-SNPs标记(UTY-19和ZFY-10)和2个Y-STRs标记(INRA189和BM861)对渤海黑牛Y染色体遗传多样性和父系起源进行研究，以期为渤海黑牛品种资源保护和利用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 样品采集及基因组DNA提取

从山东省无棣县渤海黑牛保种场采集纯种渤海黑牛公牛耳组织样15个，同时采集与日本和牛改良的渤海黑牛公牛样本15个。将样品置于75%酒精中带回并保存，采用常规的酚-氯仿抽提法提取基因组DNA，稀释浓度至20 ng/μL保存备用。

1.2 引物合成和PCR扩增

参照Gotherstrom等[6]和Ginja等[9]报道的2个家牛Y-SNPs标记(即UTY-19和ZFY-10)和Edwards等[10]报道的家牛2个经典的Y-STRs位点标记(INRA189和BM861)，引物信息详见表1,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR扩增体系总体积为12.5 μL，其中，2×TaqMasterMix 6.25 μL，上、下游引物各0.25 μL(10 pmol/μL)，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 5.25 μL。

PCR反应程序为：95℃预变性4 min；94℃变性30 s，Ta℃(表1)退火30 s，72℃延伸30 s，36个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳(含GoldView核酸染料)检测。

1.3 测序和数据分析

将PCR纯化产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。利用DNASTAR 7.1(DNASTAR, Madison, WI, USA)软件对UTY-19和ZFY-10的测序结果进行分析，找出相应的SNP和Indel位点；用GeneMarkerV1.91软件[11]对荧光微卫星标记INRA189和BM861的等位基因大小进行统计。参考Edwards等[10]和Li等[8]报道的Y染色体单倍型(Y-SNP-INRA189-BM861)判定标准，结合单倍型组结果和Y-STRs检测结果确定渤海黑牛不同个体的单倍型，再用ARLEQUIN V3.11软件进行单倍型多样度(H±SD)计算。

2 结果与分析

通过对30头渤海黑牛2个Y-SNPs标记(即UTY-19和ZFY-10)PCR扩增产物进行测序，结果显示，30头渤海黑牛包含Y1、Y2和Y3 3种单倍型组。其中15头纯种渤海黑牛中普通牛Y1单倍型组所占频率为6.67%，普通牛Y2单倍型组所占频率为20.00%，瘤牛Y3单倍型组所占频率为73.33%；15头与日本和牛杂交改良的渤海黑牛中Y1单倍型组所占频率为40.00%，Y2单倍型组所占频率为26.67%，Y3单倍型组所占频率为33.33%。

利用2个Y-STR标记INRA189和BM861分析渤海黑牛Y染色体的多态性，结果显示，INRA189标记在30头渤海黑牛中存在3个等位基因，其中98 bp等位基因对应Y1单倍型组，102 bp等位基因对应Y2单倍型组，88 bp等位基因对应Y3单倍型组。在BM861位点中，渤海黑牛的等位基因大小为158 bp和156 bp，分别对应普通牛(Y1和Y2)和瘤牛(Y3)单倍型组。

通过Y-SNPs和Y-STRs标记联合分析，在30头渤海黑牛中确认出3种单倍型(表2)。其中，15头纯种渤海黑牛中普通牛Y1单倍型Y1-98-158所占频率为6.67%(1/15)，普通牛Y2单倍型Y2-102-158所占频率为20.00%(3/15)，瘤牛Y3单倍型Y3-88-156所占频率为73.33%(11/15)，单倍型多样度为0.4476±0.1345；15头与日本和牛杂交改良的渤海黑牛中检测出普通牛Y1单倍型Y1-98-158所占频率为40.00%(6/15)，普通牛Y2单倍型Y2-102-158所占频率为26.67%(4/15)，瘤牛Y3单倍型Y3-88-156所占频率为33.33%(5/15)，单倍型多样度为0.7048±0.0535。

表1 家牛Y染色体特异性标记PCR信息

表2 渤海黑牛Y染色体单倍型频率及多样度

3 讨论

随着分子生物学的快速发展，Y-SNPs和Y-STRs分子遗传标记被广泛应用于群体遗传多样性和父系起源研究[5-10]。Li等[8]通过对中国16个黄牛品种Y染色体研究，发现中国黄牛Y染色体单倍型组存在明显的地理分布规律，即北方黄牛主要为普通牛Y2单倍型组，南方黄牛主要为瘤牛Y3单倍型组，中原黄牛存在Y2和Y3两种单倍型组；夏小婷等[12]结合Y-SNP和Y-STRs标记，发现关岭牛具有普通牛Y2和瘤牛Y3两种父系起源，父系遗传多样性较低。

渤海黑牛是我国少有的黑色毛色地方良种，其牛肉在香港市场颇受欢迎[1]。本研究通过对15头纯种渤海黑牛和15头与日本和牛杂交改良的渤海黑牛公牛进行Y-SNPs分析研究，发现纯种渤海黑牛中，普通牛Y2和瘤牛Y3所占比例最高，分别为20.00%和73.33%。该结果与Li等[8]中原黄牛为普通牛和瘤牛共同起源观点一致，这可能是普通牛和瘤牛在长期的历史进化过程中，分别从东南方向和西北方向进入我国，并在中原地区汇合的结果。其中，在15头与日本和牛杂交改良的渤海黑牛中检测出比例较高的普通牛Y1单倍型组(40.00%)。马志杰等[13]利用USP9Y基因研究发现日本和牛存在普通牛Y1单倍型组和Y2单倍型组，因此推测杂交渤海黑牛中的大量Y1单倍型组来源于用来杂交改良渤海黑牛的日本和牛Y染色体。基于线粒体DNA，王建英等[2]通过对渤海黑牛mtDNA D-loop区遗传变异分析，发现渤海黑牛为普通牛和瘤牛混合起源。本研究联合Y-SNPs和Y-STRs标记分析，15头纯种渤海黑牛Y染色体鉴定出3种单倍型，即普通牛Y1-98-158、Y2-102-158和瘤牛Y3-88-156，说明渤海黑牛Y染色体主要以瘤牛为主，同时兼有Y2普通牛血统，Y1普通牛血统很可能是日本和牛基因渗入所致，所占比例极低。本研究表明渤海黑牛的父系起源和母系起源是一致的，即为普通牛和瘤牛混合起源。

单倍型多样度(H±SD)是衡量群体遗传多样性的重要指标之一。Edwards等[10]发现138个国外牛品种的单倍型多样度为0.422±0.3；Li等[8]报道的16个中国黄牛品种单倍型多样度平均值为0.6831±0.0134，其中5头渤海黑牛的单倍型多样度为0.4000±0.2373。本研究发现，15头纯种渤海黑牛的Y染色体单倍型多样度为0.4476±0.1345，与Li等[8]报道的渤海黑牛单倍型多样度相近，且接近于国外牛品种的平均值，表明渤海黑牛具有相对较高的遗传多样性，遗传基础较丰富。15头与日本和牛杂交改良的渤海黑牛，其生长速度明显加快，更接近肉牛体型，丰富了渤海黑牛杂交牛的群体遗传结构，但应该注意与渤海黑牛原种分开饲养，不能混群。因此，应当加强对渤海黑牛种质资源的保护，建立建全保种体系，促进渤海黑牛种质资源的开发和利用。