阿卡波糖结构类似物组分A形成机制研究及其制备

2018-09-21许乐义

科技与创新 2018年18期

许乐义

许乐义

（杭州中美华东制药有限公司，浙江杭州 310000）

对形成阿卡波糖结构类似物组分A的相关机制进行了初步探究，并对其克级样品的制备进行了首次尝试。通过对实验数据的分析，形成组分A的主要原因来自于阿卡波糖的异构化，而且该过程对于菌丝体的参与并不依赖。针对于这一发现，建立了对阿卡波糖进行异构化反应，从而获得组分A的获取方法，并通过不断试验得到了使组分A达到最高获得率的条件数据。通过对中性氧化铝以及强酸型阳离子交换的层析，从异构化的反应液中获得了高纯度的组分A，为发酵液中杂质组分A的去除分离等后续系统的研究提供了材料。

阿卡波糖；结构类似物；发酵液；脱色专用树脂

本文对形成杂质组分A的机制进行尝试性的解析，并在此基础上，对如何制备组分A进行方法探究并建立相应规则，以期获得组分A在克级上的标本，对于发酵液中杂质组分A的去除分离等后续系统的研究提供了材料。

1 材料和方法

1.1 材料和设备

试验研究所需要的材料包括阿卡波糖、相关填料、中性层析氧化铝、WD-脱色专用树脂、色谱纯已腈等；所需要的仪器设备主要包括高效液相色谱仪、高压层析系统等。这些材料都可通过采购获得。

1.2 组分A的制备

1.2.1 pH值因素

分别采用定量的HC1溶液和NaOH溶液用以对阿卡波糖溶液的pH值进行调节，以使配置出来的阿卡波糖溶液是标准的。配置好标准溶液之后，在设定好的外界辅助条件的配合下，对其进行异构反应，并在过程中进行取样，以便于对阿卡波糖的含量和杂质A的含量进行检测。

1.2.2 温度因素

仅使用NaOH溶液对阿卡波糖溶液进行pH值调节，调节至一定的pH值之后，在设定好的外界辅助条件的配合下，对其进行异构反应，并在过程中进行取样，以便于对阿卡波糖的含量和杂质A的含量进行检测。

1.3 组分A的分离

1.3.1 Macro-prcp High S柱层析

在层析柱中填充一定的强酸型阳离子交换树脂，设定标准的床体积，并将其在高压层析系统上进行固定。用超纯水对填充柱进行充分平衡后，以相应的流速将定量、经过树脂进行脱色和微滤处理过的转化液泵入强酸型阳离子交换树脂填充柱中；进行样本化，并用超纯水对其进行淋洗，直至基线趋于平稳；用HC1溶液对其进行继续洗脱，并对洗脱液进行收集，分析洗脱液中各成分的组成及其相应含量。

1.3.2 中性氧化铝柱层析

通过湿法的方法，将中性氧化铝的粉末按照一定量的标准装进层析柱中，设定标准的床体积，并将其在高压层析系统上进行固定。经超纯水对填充柱进行充分的平衡之后，以相应的流速将定量的上述洗脱液泵入相应的中性氧化铝的填充柱中；进行样本化，并用超纯水对其进行淋洗，直至基线趋于平稳；使用超纯水对其进行继续洗脱，并对洗脱液进行收集，分析洗脱液中各成分的组成及其相应含量。

1.3.3 冷冻干燥

经过上述过程得到洗脱液后，对其中含有较高组分A的洗脱液进行合并，然后通过减压浓缩的方式去除部分水分，并按照标准对其进行相应时长的冷冻，最后通过对其进行冷冻干燥的方法，获得组分A的样品。

1.4 分析方法

1.4.1 对阿卡波糖进行测定的方法

利用水膜对样品进行微滤之后，对其进行相应检测，检测按照相应的标准进行。

1.4.2 对组分A进行测定的方法

检测按照欧洲药典的标准进行。

2 结果与讨论

2.1 通过异构化反应对组分A进行制备

2.1.1 LC-MS分析

在标准设定条件下，对阿卡波糖溶液进行一段时间的处理；在反应液中会有4类物质生成，将其分别标注为Ⅰ类物质、Ⅱ类物质、Ⅲ类物质、Ⅳ类物质。通过对反应液进行液质联用分析后发现，残留在反应液中的阿卡波糖的相对分子量等同于Ⅳ类物质的相对分子量，由此证明Ⅳ类物质为阿卡波糖的同分异构体。同时，在出峰时间上进行对比发现，相比于阿卡波糖，组分A是其0.9倍，并对保留时间进行参考比较，得出了Ⅳ类物质即为杂质组分A的结论。这也从侧面论证了形成组分A的原因之一就是阿卡波糖的异构化反应，且在此过程中，可能并不依赖于菌丝体参与。

2.1.2 阿卡波糖异构化反应中pH值的影响

经大量实验表明，pH值对反应液中通过阿卡波糖异构化的作用生成组分A在效率上有明显的影响。通过对实验数据的分析观察到，当pH等于11时，通过异构化的反应可获得最多的组分A，并在3 h内异构化的反应趋于平衡，如图1所示；当pH等于12时，对于组分A的初反应的形成速度是最快的，但反应过程随着时间的延长，组分A的含量出现逐步下降的情况，同时，Ⅰ类物质、Ⅱ类物质、Ⅲ类物质的生成含量相比于其他处理组织也呈现出明显增多的现象。由此可以确定，在阿卡波糖异构化的反应过程中，pH值应设定为11.

图1 pH对阿卡波糖异构化反应的影响

2.1.3 异构化的反应过程中温度的影响

经过大量的实验数据表明，在一定的设定温度区间内，随着温度的升高，对阿卡波糖的异构化反应用于生成组分A这一过程越来越有利，并对其反应速度也有明显的加速提升作用。这一温度区间为30～70 ℃，通过对实验数据的线性化曲线表现不难发现，当温度达到60 ℃之后，曲线趋于平稳，温度对反应过程的影响开始变小。同时，对反应过程中生成的Ⅰ类物质、Ⅱ类物质、Ⅲ类物质进行了温度影响的研究。研究数据表明，随着温度的升高，Ⅰ类物质、Ⅱ类物质、Ⅲ类物质的生成不断加快，其中，Ⅱ类物质受温度影响的变化最为明显，同样，对其相应的实验数据进行线性化，得到其二维曲线图。经过对比发现，在设定60 ℃和70 ℃温度条件下，对于生成的组分A的含量进行观察，发现组分A的含量进本持平，但是在对2个温度下生成的3种杂质含量进行对比时发现，60 ℃下的生成量低于70 ℃下的生成量，由此可以确定，在阿卡波糖异构化的反应过程中，60 ℃为最优反应设定温度。

2.1.4 异构化的反应过程中菌丝体的影响

经实验研究表明，在设定的标准外界辅助环境中，通过阿卡波糖的异构化反应获得组分A的这一反应能够实现自发进行，但是存在着其异构化反应不是非常明显的情况。通过在反应液中分别添加菌丝体以及菌丝体裂解液，从而达到对转化阿卡波糖这一过程的促进作用，但这一方法对生成组分A的影响微乎其微。除此之外，对pH值进行调整发现，当pH等于11时，对通过阿卡波糖的异构化反应生成组分A这一反应有明显的强化作用。

2.2 对组分A的提取

2.2.1 Macro-prcp High S柱层析

由于组分A与阿卡波糖为同分异构体，因此，阿卡波糖所含有的阿卡维基机构其同分异构体的组分A也同样具有，在理论层面上，对组分A也同样能够通过阳离子交换树脂的方法实现吸附分离。试验中，通过使用强酸型阳离子交换剂实现对阿卡波糖以及组分A的吸附；采用HC1溶液洗脱的方法对其进行处理。经过对实验的观察以及对结果的分析发现，组分A具有较弱的结合树脂的能力，最先被洗脱，随后Ⅰ类物质、Ⅱ类物质、Ⅲ类物质被洗脱。利用离子交换层析的方法实现对Ⅰ类物质、Ⅱ类物质的去除，并使Ⅲ类物质的含量降低，从而获得去除杂质的只包含阿卡波糖和组分A的洗脱液，但是这一方法不能够实现对阿卡波糖和组分A的分类。

2.2.2 中性氧化铝柱层析

通过利用中性氧化铝与组分A空间结构不同的原理，尝试利用中性氧化铝层析柱实现对阿卡波糖以及组分A分离，效果明显。实验结果表明，这一方法可以有效地实现对阿卡波糖以及组分A的分离以及纯度的提高。通过强酸型阳离子交换层析、中性氧化铝层析方法分步骤实现了对组分A的样品提取，为后续其相关研究提供了基础材料。