液相色谱法检测生物样本中苯肽胺酸的含量＊

程炜，汤俊梅



液相色谱法检测生物样本中苯肽胺酸的含量＊

程炜，汤俊梅

（苏州健雄职业技术学院，江苏 苏州 215411）

采用液相色谱法检测生物样本中苯肽胺酸的含量，进一步探究苯肽胺酸药物的使用价值。选取适宜研究的大鼠血样和组织样本，采用液相色谱法对含有苯肽胺酸的空白样本进行检测，且使色谱条件优化，将含有苯肽胺酸药物的杂峰和色谱峰有效分离。运用不同流动相对大鼠血样和组织样本进行洗脱，研究观察液相色谱法的验证结果，并对样本的稳定性和绝对回收率情况进行研究。结果表明，不同质量浓度下样本的日间精密度和日内精密度的相对标准差为0.17%～1.72%，重复性的相对标准差为3.58%～3.82%；室温和冻存环境下不同浓度质量浓度样本的相对标准差为0.52%～3.72%，药物回收率为92.3%～98.5%；大鼠血样的绝对回收率为92.9%～96.7%，相对标准差为0.14%～5.01%，组织样本的绝对回收率为85.5%～97.7%，相对标准差为0.15%～5.02%.因此，采用液相色谱法检测生物样本中苯肽胺酸的含量具有良好的稳定性和重复性，且符合实验要求，可用于相关实验，值得进一步推广和应用。通过实验研究发现，药物的色谱峰的峰型会受到pH值的影响。

液相色谱法；生物样本；苯肽胺酸；SD大鼠

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 实验动物的资料

选取多只健康成年的雄性SD大鼠在普通条件下饲养，大鼠的体质量为232～315 g，平均体质量为（269.2±2.4）g。

1.1.2 研究物的资料

苯肽胺酸，粉末状，淡黄色，与有机溶剂相溶，微溶于水，在光环境下稳定性差，质量分数为96%以上。

1.1.3 使用试剂的资料

氯化钠（国药准字H20123141，100 mL：0.9 g，化学药品，宜昌三峡制药有限公司）、乙腈（国药准字H10973068，化学药品，广东希埃医药有限公司）和甲酸。

1.1.4 仪器设备的资料

液相色谱仪（2695电化学检测器，产自美国惠普公司）、PDA检测器（产于美国的Waters公司）、XB-NH2色谱柱（来源于中国科学院大连化学物理研究所，规格为4.6 mm×250 mm）、T18均浆机（产于德国的伊卡集团）和KDC-160HR高速冷冻离心机（来源于可达创新股份有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠血样的处理

取大鼠100 μg的空白血清加入200 μg苯肽胺酸溶液中均匀摇晃，并根据实验要求在无光环境下保存。加入600 μg含甲酸质量分数为0.4%的乙腈溶液中，在4 ℃的环境下进行离心分离，分离速度为15 000 r/min，分离结束后取0.22 μm的上清液，然后在过滤器上过滤，留置过滤液待测。

1.2.2 组织样本的处理

取组织样本0.3 g，然后加入0.5 mL的苯肽胺酸溶液中混匀，在适当条件下保存；加入1.2 mL含甲酸质量分数为0.4%的乙腈溶液中混匀，放置30 min后加入0.6 mL的氯化钠溶液中后进行混匀，放置20 min后溶液分层，将上层溶液放置于离心管内，在室温环境下进行离心分离，分离速度为3 000 r/min；结束后取上清液，再进行15 000 r/min的离心分离8 min，取0.22 μm的上清液，然后在过滤器上进行过滤，留置过滤液待测。

1.3 统计学方法

应用SPSS18.0对数据进行分析，其中，计数进行2（%）检验，计量进行检测（±）检验，＜0.05提示有明显差异。

2 实验结果

2.1 日间和日内精密度、重复性的验证结果

在100 mg/L、10 mg/L、1 mg/L的样本质量浓度下，样本的日间精密度和日内精密度的相对标准差为0.17%～1.72%，重复性的相对标准差为3.58%～3.82%，具体如表1所示。

表1 液相色谱法对日间和日内精密度、重复性的验证结果

样本质量浓度/（mg/L）实际质量浓度/（mg/L）标准差相对标准偏差/（%） 日内精密度100100.250.1620.17 109.870.1671.72 10.980.0010.19 日间精密度100100.250.1620.17 109.870.1671.72 11.000.0050.65 重复性10099.353.5413.62 109.870.3813.85 11.020.0363.58

2.2 样本稳定性的研究

在100 mg/L、25 mg/L、2 mg/L的样本质量浓度下，经研究得，室温和冻存环境下的相对标准差为0.52%～3.72%，药物回收率为92.3%～98.5%，具体如表2所示。

表2 室温和冷存环境下样本稳定性的分析研究

组别样本质量浓度/（mg/L）回收率/（%） 标准差相对标准偏差/（%） 12平均值 冻存10096.7 99.598.50.0131.35 2597.2 97.597.40.0050.52 298.2 92.396.30.0363.72 室温10099.5 98.298.50.0111.65 2597.2 99.397.90.0131.23 290.5 93.292.30.0232.41

2.3 样本回收率的处理结果

加入药物后测定的样本色谱峰的面积为0，通过稀释后得到色谱峰的面积为1，绝对回收率=01×100%.组织样本的样本主要有脾脏、心脏、肝脏、大脑以及脂肪样本等组织，通过对组织样本和大鼠血样回收率的研究得出，大鼠血样的绝对回收率为92.9%～96.7%，相对标准差为0.14%～5.01%，组织样本的绝对回收率为85.5%～97.7%，相对标准差为0.15%～5.02%.

3 结论

在本次实验研究中，样本日内和日间精密度的相对标准偏差均小于2%，且重复性的相对标准偏差均小于5%，样本的回收处理率均大于90%，样本稳定性均小于5%，所以，建立液相色谱法具备简易、重现性高、方便等优点，其检测方法可作为药物检测的方法。此外，采用液相色谱法分离生物样本中的苯肽胺酸是由苯肽胺酸自身的熔点和分解温度决定的，利用此方法可充分测定其含量。

在本次研究中，选用XB-NH2色谱柱作为分析生物样本中苯肽胺酸含量的分析柱，有利于药物中的色谱峰和血样样本中的杂峰有效分离。通过实验发现，流动相的pH值与有机相的比例情况会对药物的分离效果产生一定的影响。综上所述，采用液相色谱法检测生物样本中苯肽胺酸的含量具有良好的稳定性和重复性，且符合实验要求，可用于相关实验的实验参考方法，值得进一步推广和应用。通过实验研究发现，药物的色谱峰的峰型会受到pH值得影响。

［1］韦思华，代玲玲，周峰，等.高效液相色谱法检测生物样本中苯肽胺酸的含量［J］.农药，2016，25（01）：33-35.

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2095－6835（2018）18－0130－02

S482.8

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2018.18.130

2017 年苏州健雄职业技术学院“三级联动”科研基金项目与专项课题“液相色谱-串联质谱测定犬尿氨酸的方法开 发与验证”（课题编号：2017SJLD19）阶段成果

〔编辑：张思楠〕