正交设计优选甘草多糖的提取工艺

刘永岭 王艳艳

摘要：本文主要对甘草多糖的提取工艺进行研究。对影响甘草多糖提取的影响因素进行单因素实验研究，根据单因素实验结果设计L9（34）正交实验，最后得出提取温度90℃，提取时间2小时，料液比1：20提取效果为最佳。

Abstract： This article mainly studys on the extraction of Glycyrrhiza polysaccharide. Influencing factor of effect of extracting Glycyrrhiza polysaccharide is the temperature of extracting， the time of extracting， the amount of dissolvent. To choice the best condition of the extraction of Glycyrrhiza polysaccharide， we contrive single factor and orthogonal experiments，conclusion： the temperature of extracting is 90℃， the time of extracting is 2h， the amount of dissolvent is 20 times，which is the best condition.

关键词： 甘草多糖；蒽酮-硫酸法；正交设计；提取工艺

Key words： glycyrrhiza polysaccharide；anthrone and sulfuric acid method；orthogonal design；extract technology

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2018）26-0249-03

0 引言

大量的研究已证实，植物多糖具有免疫调节作用，如有报道证明甘草多糖溶于水，能够直接作用于人体免疫系统，活化休眠的免疫细胞，使其分泌出更多的免疫因子，从而增强人体抗病能力，同时，还具有抗炎、抗病毒、抗衰老以及修复自身免疫性疾病的功效。此外还有报道证明甘草多糖也具有多种免疫增强功能，能激活网状内皮系统，具有抗、补体活性，直接刺激B淋巴细胞增殖，诱导人体中IgM、IgG的产生，还能诱生和促诱生干扰素，增强机体的杀伤细胞活性[1]。甘草为豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflataBat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabraL.）的干燥根及根茎，为多年生草本植物。喜生于沙滩、草原，主产于新疆、内蒙、山西、甘肃等地，是传统常用中草药之一[2]，俗称“众药之王”，入药已有悠久历史。

甘草的主要活性成分为甘草黄酮类和甘草皂苷类成分。其中黄酮类成分主要有甘草苷、异甘草苷、甘草素和异甘草素等，甘草皂苷类成分主要为甘草酸、甘草多糖、甘草皂苷G2和乌拉尔甘草皂苷B等[3]。黄酮类主要溶于有机溶剂不溶于水，甘草多糖溶于水，不溶于有机溶剂，利用这两点性质，就可以设计在概的提取工艺，即先醇提，再水提。然后根据国内外专家学者对甘草多糖研究的基础上，本实验采用水煮法从粉碎的甘草根中提取水溶性甘草多糖，通过对所提甘草多糖的得率及浸膏得率进行比较，从而筛选出甘草多糖更为简单高效的提取工艺。

1 实验材料与仪器

蒽酮、乙醇、薄层层析硅胶（100-140目）（国药集团化学试剂有限公司）；葡萄糖标准品（中国药品生物制品检定所）；UV-9600型紫外-可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵旋蒸（郑州长城科工贸有限公司）；HH-S数显恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂）； ZF 超声波清洗机（上海致丰电子科技有限公司）；LD5-2A型离心机（北京医用离心机厂）。

2 实验方法

2.1 标准曲线的绘制

蒽酮溶液的配制：（现配现用）精密称取50.00mg蒽酮用76%稀H2SO4（76ml浓H2SO4加30ml水中）定容到50ml。

標准溶液的配制：精密称取105℃干燥恒重的葡萄糖25.00mg，加蒸馏水25ml，配成1mg/ml的标准溶液备用。

标准曲线的绘制：分别量取标准液0.5，1.0，1.5，2.0， 2.5，3.0ml于25ml容量瓶中，分别加蒸馏水定容摇匀，再分别吸取不同浓度的葡萄糖溶液各1ml，加5ml蒽酮试液，放入冰水浴中摇匀后，置沸水浴中煮10min，取出用水冲洗2min 冷却，静置10min后于624nm 处开始测定吸光度，以蒸馏水1.0ml 同上作空白对照。

以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作回归处理，得回归方程为y = 0.0047x + 0.0325 R2 = 0.9982 葡萄糖在20～120μg/ml 范围内吸光度呈良好线性关系。

2.2 单因素实验

2.2.1 实验方法

①醇提取：分别称取10.00g甘草粉末（用粉碎机粉碎过40目筛），用80%的乙醇按1：5的量分别提取两次，每次1小时，抽滤，得药渣，备用。

②水提取：将上述所得药渣按单因素实验条件进行实验。

③测定A：将所得的滤液定容到500ml，再稀释25倍，用绘制标准曲线的方法进行测量吸光度。

④浸膏：取定容到500ml 的滤液50ml 在旋转蒸发仪上进行浓缩，再放入恒温干燥箱里干燥，冷却后称其质量为M2。

2.2.2 实验结果

①提取时间的影响

注：浸膏得率（%）=[（m2-m1）*500ml/（50ml*10g）]*100% （1）

注：提取率（%）=（A-0.0325）/0.0047*1000*25*500/10000*100% （2）

②提取温度的影响（图3、图4）

③料液比的影响（图5、图6）

2.2.3 实验结果分析

提取时间对甘草多糖提取得率的影响如图1所示，在2.0h前提取率随时间的增加而增加，到2.5h开始减少，即2.0h时达到最大。提取温度对甘草多糖提取得率的影响如图2所示，在60～90℃，提取率随温度的增加而上升，90℃后就有所下降。料液比对甘草多糖提取得率的影响如图5所示，提取率随料液比的增大而增加，但在1：30以后增加的趋势减缓。

综上所述，再考虑生产成本和工艺等条件，可选取表2按L9（34）正交表做实验。

2.3 正交实验

根据上述的因素表可得到如下的实验设计，如表3。

根据上述的正交实验方案表做实验，可得到如表4和表5结果。

甘草多糖提取条件正交优化实验结果见表5。根据极差分析结果可知，各种因素对提取效果的影响顺序为：A>C>B；最佳水平组合為：A3B2C1，即最佳工艺条件为反应温度90℃，反应时间2.0小时，料液比1：20，可得提取率和浸膏得率最高。

2.4 验证实验

取10.00g甘草粉末用1：5的80%乙醇分别提取两次，每次1小时，抽滤，得滤渣，再用1：20的蒸溜水量，在90℃下，提取2小时。最后抽滤得滤液，定容到500ml的容量瓶中，再稀释25倍，按做标准曲线的方法测其吸光度为0.315，并计算提取率为7.51%，浸膏得率为12.45%。

3 结论

本实验通过单因素实验得到相应的条件对甘草多糖提取率和浸膏得率的影响，即提取时间对提取率和浸膏得率的影响，在0.5～2.0h之间是随时间的增加而提高，但在2.0h后就随时间的延长而明显降低；提取温度对提取率和浸膏得率的影响，在60～90℃之间是随温度的升高而增加，在90℃后就减少了；料液比对提取率和浸膏得率的影响，它们都随溶剂的增加而增加，但在1：30时增加的趋势开始减缓，所以我们选取了提取时间1.5、2.0、2.5，提取温度70℃、80℃、90℃，料液比1：20、1：25、1：30，这三个水平做为正交实验因素水平进行正交实验设计。把正交实验的结果进行分析，可知在反应温度90℃，反应时间2.0小时，料液比1：20条件下提取甘草多糖可以得到较高的提取率和浸膏得率。且为了提取多糖纯品，用80%乙醉处理药材，以除去单糖、低聚糖、苷类及生物碱等干扰性成分，用水提取其中的多糖。

参考文献：

[1]董永军，王丽荣，王宪文，李园园，杭柏林，梁美兰，马要峰.甘草多糖的提取及其对肉仔鸡免疫功能的影响[J].江苏农业学报，2008（5）：692.

[2]孙萍，李艳，顾承志，陈宏伟.甘草多糖的微波提取及含量测定[J].基层中药杂志，2001（6）：22.

[3]李伟，王跃飞，文红梅，崔小兵，赵晓莉.HPLC-DAD同时分析甘草中7种有效成分[J].中国药学杂志，2008（24）：1914.