恶臭假单胞菌的采集及菌种鉴定分析

2018-09-20韩金鑫

山东化工 2018年15期

韩金鑫

(天津冶金职业技术学院，天津 300400)

碳酸盐岩在自然界中广泛分布，在碳酸盐岩的表面具有多种多样的微生物存在[1]，微生物的新陈代谢及生命活动对碳酸盐岩的风化、表面形貌及周边环境都有重要影响。白云岩作为典型的碳酸盐岩，其表面分布着多种重要的微生物[2]。微生物的生长繁殖及其代谢活动不仅可以加速岩石矿物的风化，还可以促进或诱导矿物的合成[3]。恶臭假单胞菌作为白云岩表面的优势菌株对其具有重要的矿化作用[4]。

近年来，随着分子生物学研究技术在微生物生态学研究中的广泛应用，依赖于DNA的系统发育的多样性研究已经成为微生物多样性研究的重要代表[5]。微生物种类繁多，各种微生物具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类[6]。利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。生理生化实验的方法很多，本文主要研究对该菌株具有判断影响的几种实验。本文选用分离自白云岩表面的恶臭假单胞菌作为实验菌株。将其编号为DCB13菌株。

1 材料与方法

1.1 恶臭假单胞菌的采集

白云岩样品采集自贵州省贵阳市云岩区阿哈水库旁，选择表面微生物丰富的白云岩矿物，以地质锤凿取岩石矿物，除去污染部分后收集在无菌袋中保存。

在实验室中用无菌水清洗数次，刮取表面微生物在牛肉膏蛋白胨固体培养基中生长数天，待其大量繁殖后，挑取生长旺盛的疑似恶臭假单胞菌的单菌落，经过数次纯化培养后待用，将其编号为DCB13菌株。

1.2 生理生化实验

根据伯杰细菌手册[7]、常见细菌系统鉴定手册[8]、一般细菌常用鉴定方法及环境微生物实验技术[9]等，对DCB13菌株进行生理生化实验鉴定。

主要实验包括：(1)氧化酶实验；(2)过氧化氢酶实验；(3)淀粉水解实验；(4)吲哚实验；(5)甲基红实验(M.R.实验)；(6)乙酰甲基甲醇实验(V-P实验)；(7)利用柠檬酸盐实验；(8)产H2S实验；(9)硝酸盐还原实验；(10)葡萄糖氧化发酵实验。

1.3 DNA测序实验

1.3.1 DNA提取

参照分子生物学实验指南的方法[10]，提取基因组DNA。

1.3.2 16S rDNA的PCR扩增反应

选用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)、引物T7 promotor (5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′)及引物SP6 promotor(5′-ACGATTTAGGTGACACTATAG-3′)。

PCR反应体系：10×PCR buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 4 μL，Taq DNA 聚合酶(5U/μL) 0.5 μL，dNTPMixture(各 2.5 mmol/L) 4?L，27F(10 μmol/L) 2μL，1492R(10 μmol/L) 2μL，模板DNA 1μL，用灭菌双蒸水补足至50μL。

PCR反应条件：先94 ℃ 5min，再94 ℃ 1min、52 ℃ 1min和72 ℃ 2min，30个循环，最后72 ℃延伸10min。

取PCR产物5.0 μL于1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果。

1.3.3 DNA测序

测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

2 结果与讨论

2.1 生理生化实验结果

氧化酶实验中在培养基中接入恶臭假单胞菌DCB13菌株，菌苔8s呈红色，测试结果为阳性(+)；过氧化氢酶实验中接入恶臭假单胞菌DCB13菌株，滴加H2O2有气泡产生，测试结果为阳性(+)；淀粉水解实验中接入恶臭假单胞菌DCB13菌株，菌苔周围无透明圈出现，测试结果为阴性(-)；吲哚实验中接入恶臭假单胞菌DCB13菌株，溶液呈红色，测试结果为阳性(+)；甲基红实验(M.R.实验)中接入恶臭假单胞菌DCB13菌株，溶液呈无色，测试结果为阴性(-)；乙酰甲基甲醇实验(V-P实验)中接入恶臭假单胞菌DCB13菌株，培养液不呈红色，测试结果为阴性(-)；利用柠檬酸盐实验中接入恶臭假单胞菌DCB13菌种，培养基颜色变为蓝色，测试结果为阳性(+)；产H2S实验中接入恶臭假单胞菌DCB13菌株，使滤纸条不变黑，测试结果为阴性(-)；葡萄糖氧化发酵实验中接入恶臭假单胞菌DCB13菌株，试管中颜色由上向下变色，属氧化型。