菌酶联合制备猪血抗氧化低聚肽

安攀宇，肖岚，何佩芸，谢巧，黎苹，黄晓红

（四川旅游学院食品学院，四川成都610100）

猪血是猪屠宰行业的副产物，我国作为世界养猪大国，猪血资源丰富，但开发利用较落后[1]，不仅浪费了生物资源也造成严重的环境污染，因此开发利用猪血蛋白资源受到了广泛重视。近年来，国内外利用猪血制备抗氧化肽的研究较多，如张凤英等[2]采用不同的蛋白酶对猪血红蛋白进行酶解，得出中性蛋白酶酶解猪血红蛋白得到的产物抗氧化活性最好，还原力为0.432。唐雯倩等[3]利用超声波辅助胰蛋白酶水解猪血血红蛋白制备抗氧化肽，DPPH·最高清除率为75.78%。孔卓姝[4]以猪血红蛋白为原料，研究7种蛋白酶水解制备抗氧化肽的工艺，胃蛋白酶的水解度和还原力最佳，经响应面优化所得酶解液的还原力为2.665。本试验拟将枯草芽孢杆菌发酵法和碱性蛋白酶酶解法结合，建立一个优化的菌酶联合制备猪血抗氧化肽的方案，选取7种体外抗氧化活性指标（·OH清除率、·O2-清除率，抑制脂质过氧化能力、还原力、ABTS＋·清除率、DPPH·清除率、总抗氧化力）综合评价枯草芽孢杆菌发酵、碱性蛋白酶水解、分子量大小对猪血抗氧化低聚肽活性的影响，筛选出猪血抗氧化低聚肽的最佳制备方法，以期获得活性较高的猪血抗氧化低聚肽，为其在食品添加剂、医疗、保健用品等的开发利用上提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪血：成都伍田食品有限公司；枯草芽孢杆菌（SICC.197.）：四川省微生物资源平台菌种保藏中心；碱性蛋白酶（酶活力为85.61 U/g）：上海Kayon公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

挑取活化后的枯草芽孢杆菌，接入装有50 mL液体培养基[5]的锥形瓶中，放在恒温振荡培养箱中培养，温度为35℃，转速135 r/min，培养12 h，得到种子培养液（1×109cfu/mL）。

1.2 仪器与设备

HHS-8S电子恒温不锈钢水浴锅：上海光地仪器设备有限公司；UV Power紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科仪器有限公司；H2050R台式高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机有限公司；QYC-2102C恒温振荡培养箱：上海福玛实验设备有限公司；FD-1冷冻干燥机：北京德天佑科技发展有限公司；GZ-150-S生化培养箱：韶关市广智科技设备有限公司；GM-0.33隔膜真空泵：天津市津腾实验设备有限公司；超滤管（截留分子量分别为5 000、1 000 Da）：德国Sartorius公司。

1.3 试验方法[6]

1.3.1 枯草芽孢杆菌发酵猪血工艺的优化

1.3.1.1 单因素试验

选取发酵时间、底物浓度、枯草芽孢杆菌接种量3个因素进行单因素试验。

1）发酵时间的确定：在250 mL锥形瓶中配置浓度为70 g/L的猪血液100 mL，121℃，高压灭菌20 min，接入1∶40（体积比）的种子液，35℃135 r/min的振荡培养箱中分别培养 48、60、72、84、96 h。

2）底物浓度的确定：在250 mL锥形瓶中分别配置浓度 30、50、70、90、110 g/L 的猪血液 100 mL，121 ℃，高压灭菌20 min，接入1∶40（体积比）的种子液，35℃，135 r/min的振荡培养箱中培养60 h。

3）接种量的确定：在250 mL锥形瓶中配置浓度为70 g/L的猪血血液100 mL，121℃，高压灭菌20 min，按体积比分别接入 1∶100，1∶50，3∶100，1∶25，1∶20 的种子液，35℃，135 r/min的振荡培养箱中培养60 h。

1.3.1.2 响应面优化试验

在单因素试验结果基础上，以·OH清除率作为响应值，对猪血液态发酵中的发酵底物浓度、发酵时间、枯草芽孢杆菌接种量3个因素进行三因素三水平的Box-Behnken Design（BBD）响应面优化试验，得出制备猪血抗氧化低聚肽的最佳发酵工艺。

1.3.2 酶解猪血发酵液工艺的优化

1.3.2.1 单因素试验

将最优条件下制备的猪血发酵解液于6 000 r/min离心15 min得上清液，研究酶解温度、酶解时间、pH值、酶底比对上清液多肽含量的影响。

1）酶解温度：100 mL 发酵上清液分别为 45、50、55、60、65℃，pH 9.5，酶底比为250 U/g的条件下酶解3 h。

2）酶解时间：100 mL发酵上清液在55℃，pH9.5，酶底比为 250 U/g的条件下分别酶解 1、2、3、4、5 h。

3）pH值：100 mL发酵上清液在55℃，pH值分别为 9.0、9.5、10.0、10.5、11.0，酶底比为 250 U/g条件下酶解3 h。

4）酶底比：100mL发酵上清液在 55℃，pH9.5，酶底比分别为 50、150、250、350、450 U/g的条件下酶解 3 h。

1.3.2.2 响应面试验

根据单因素试验结果，以酶解时间、pH值、酶解温度、酶底比为影响因素，多肽含量为响应值，通过四因素三水平的Box-Behnken Design（BBD）响应面试验设计优化酶解工艺。

1.3.3 超滤制备猪血肽

酶解后的发酵液于4℃，6 000 r/min高速离心20 min，取其上清液，经0.45 μm滤膜过滤，去除菌体及残渣；采用截留分子量为5、1 kDa的超滤离心管对膜过滤液进行分离（4 000 r/min，10 min），收集各超滤组分冷冻干燥，测定其抗氧化指标的IC50。

1.3.4 相关指标的测定

1.3.4.1 多肽含量的测定

参照陈昌琳[7]的方法，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定上清液蛋白质含量，计为上清液中多肽含量。

1.3.4.2 体外抗氧化活性的测定

·OH清除率测定参照TIAN F等[8]的方法、·O2-清除能力测定参照殷微微等[9]的方法，抑制脂质过氧化能力测定参照Chen Naifu等[10]方法、还原力测定参照刘昭明等[11]的方法、ABTS＋·清除率测定参照潘瑶等的[12]方法、DPPH·清除率测定参照朱夕波等[13]的方法、总抗氧化力测定参照YANG M等[14]的方法。

1.3.4.3 半抑制浓度（IC50）值的测定

将冻干样品稀释成不同浓度（试验点≥5），分别测定其·OH清除率、·O2-清除率、抑制脂质过氧化能力、还原力、ABTS＋·清除率、DPPH·清除率、总抗氧化力。以样品浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制成圆滑曲线，根据曲线计算IC50值。

2 结果分析

2.1 枯草芽孢杆菌发酵猪血工艺优化的结果

2.1.1 枯草芽孢杆菌发酵猪血单因素试验结果

发酵时间、底物浓度和接种量对·OH清除率的影响见图1。

图1 发酵时间、底物浓度和接种量对·OH清除率的影响Fig.1 The effect of fermentation time，substrate concentration and inoculumssize on·OH scavenging rate

发酵时间对枯草芽孢杆菌发酵上清液·OH清除率的影响，如图1A所示，发酵上清液·OH清除率呈先升高后下降趋势，当发酵时间为60 h时达到最高值60.22%，与·OH清除率最低值差异显著（p＜0.01）。底物浓度对发酵上清液·OH清除率的影响如图1B所示，发酵上清液·OH清除率随底物浓度的增加先上升后下降，当底物浓度为50 g/L时达到最高值61.58%，底物浓度对·OH清除率影响显著（p＜0.05）。接种量对上清液·OH清除率的影响如图1C所示，发酵上清液·OH清除率随接种量增加显著提高（p＜0.05），在接种量达到3∶100（体积比）时达到最高值64.49%，之后再增加接种量，·OH清除率下降。

2.1.2 枯草芽孢杆菌发酵猪血响应面试验

利用Design Expert软件对响应面试验数据进行多元回归拟合分析，响应面试验结果见表1。对该模型进行方差分析见表2。

表1 响应面试验设计及结果Table 1 Design and results of response surface test

表2 方差与显著性分析Table 2 Analysis of variance and significance test

如表2所示，所选模型的Prob＞F值0.000 9（＜0.01），即为不同处理组间差异极显著，说明用回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，其应变量与全体自变量之间的线性关系显著，即该试验方法可靠。该模型中，A、B、C、AB、AC、B2、C2对发酵上清液·OH 清除率影响显著，即底物浓度、发酵时间、接种量、底物浓度和发酵时间的交互作用以及底物浓度和接种量的交互作用对发酵上清液的·OH清除率有显著影响。且影响程度大小为，接种量＞底物浓度＞发酵时间。

该模型失拟项的Prob＞F值为0.684 7（＞0.05），即失拟项差异不显著，说明该方程对试验拟合情况好，试验误差小。该模型拟合度R2=0.949 9，校正拟合度R2=0.885 4表示该模型能够解释·OH清除率有94.99%的变化来源于所选变量，说明该模型适合用于研究底物浓度、发酵时间和接种量3个因素的变化对猪血发酵上清液·OH清除率的影响和预测分析。仅总变异约12%不能用此模型来解释，也能合理地说明校正拟合度R2=0.885 4的变化。信噪比为10.320，大于4，回归方程拟合度和可信度较高。对表2中数据进行回归拟合分析，以发酵上清液·OH清除率为响应值（Y），得到各因素对响应置的二次多项回归方程为：

由方程预测得到最佳发酵条件是底物浓度59.07 g/L，发酵时间 56.4 h，接种量3.22∶100（体积比），此时·OH清除率为78.94%。根据所得的分析数据进行3组重复验证试验，此条件下得到猪血发酵上清液·OH清除率为77.48%，测定结果稳定，偏差不大，证明预测结果合理可靠。

通过回归方程所作出响应面曲面图及等高线见图2和图3。

图2 底物浓度与发酵时间交互作用对·OH清除率影响的响应曲面图及等高线图Fig.2 Response surface map and contour map of the interaction of substrate concentration and fermentation time on·OH scavenging rate

可直观反映底物浓度与发酵时间交互作用以及底物浓度与接种量对发酵上清液·OH清除率的影响，且响应面曲面坡度较陡，说明交互作用对响应值影响较显著，与表2结果一致。

如图3所示，两因素之间的影响基本呈抛物线型关系，且均有一个极大值点。从图2和图3中可以看出，随着底物浓度的增大，猪血发酵上清液中的·OH清除率逐渐增大；随着发酵时间的增加，·OH清除率呈现先增大后降低的趋势。分析其原因，可能是因为随着发酵延长，由于底物消耗殆尽，因此产生的猪血抗氧化肽含量达到极值后不再增加反而开始降低，因此对于·OH清除率也呈现出相同趋势。等高线呈圆形说明两因素交互作用不显著，呈椭圆或者马鞍形则表明交互作用显著，该结果均与回归模型方差分析表一致。

图3 底物浓度与接种量交互作用对·OH清除率影响的响应曲面图及等高线图Fig.3 Response surface map and contour map of the interaction of substrate concentration and inoculum concentration on·OH scavenging rate

2.2 酶解猪血发酵液工艺优化的结果

2.2.1 酶解猪血发酵液单因素试验结果

酶解温度、酶解时间、pH值和酶底比对多肽含量的影响见图4。

图4 酶解温度、酶解时间、pH值和酶底比对多肽含量的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature、enzymatic hydrolysis time、pH and enzyme/substrate on polypeptide content

由图4A可知，多肽含量随温度的增高呈先上升后下降趋势，当温度达到65℃时，多肽含量最高2.92mg/mL，温度对多肽含量的影响不显著（p>0.05）。由图4B可知，随着酶解时间延长多肽含量增加，酶解时间3 h时，多肽含量最高，为3.01 mg/mL，之后随酶解时间延长，多肽含量降低，酶解时间对多肽含量的影响不显著（p>0.05）。由图4C可知，随着pH值升高多肽含量呈先上升后下降趋势，pH值为9.5时，多肽含量最高，为3.01 mg/mL，pH值对多肽含量的影响不显著（p>0.05）。由图4D可知，多肽含量随酶底比增加而快速增加，酶底比为350 U/g时，多肽含量达到最高3.42 mg/mL，随后降低，酶底比对多肽含量的影响不显著（p>0.05）。

2.2.2 酶解猪血发酵液响应面试验

在单因素试验基础上，采用四因素三水平对酶解液多肽含量进行响应面优化试验，试验结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface test

续表3 响应面试验设计及结果Continue table 3 Design and results of response surface test

表4 方差与显著性分析Table 4 Analysis of varlance and significance test

如表4所示，所选模型的Prob＞F值＜0.0001，即为不同处理组间差异极显著，说明用回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，其应变量与全体自变量之间的线性关系显著，即该试验方法可靠。该模型中，A、D、AC、BD、A2、B2、C2和 D2对多肽含量影响显著，即酶解时间、酶底比、酶解时间与酶解温度、pH值与酶底比的交互作用对酶解液的多肽含量有显著影响。

该模型失拟项的Prob＞F值为0.079 4（＞0.05），即失拟项差异不显著，说明该方程对试验拟合情况好，试验误差小。该模型拟合度R2=0.975 3，校正拟合度R2=0.950 5表示该模型能够解释·OH清除率有97.53%的变化来源于所选变量，说明该模型适合用于研究酶解时间、酶底比、酶解温度以及pH值4个因素的变化对猪血酶解液的多肽含量的影响和预测分析。仅总变异约5%不能用此模型来解释，也能合理地说明校正拟合度R2=0.950 5的变化。信噪比20.568，大于4，回归方程拟合度和可信度较高。

对表4中数据进行回归拟合分析，以猪血酶解液的多肽含量响应值（Y），得到各因素对响应值的二次多项回归方程为：

通过多肽含量模型的二元多次回归方程所作的响应面曲面图见图5、图6，分别表示酶解时间与酶解温度及pH值与酶底比交互作用对酶解液多肽含量的影响。响应曲面坡度较大，说明响应值对于处理条件较敏感，与表4结果一致。

图5 酶解时间和酶解温度交互作用对多肽含量影响的响应曲面图及等高线图Fig.5 Response surface map and contour map of the interaction of enzyme Time and enzyme temperature on polypeptide content

图6 pH值和酶底比交互作用对多肽含量影响的响应曲面图及等高线图Fig.6 Response surface map and contour map of the interaction of pH and enzyme/substateon polypeptide content

如图5所示，两因素之间的影响基本呈抛物线型关系，且均有一个极大值点。从图中可以看出，多肽含量随着酶解温度的升高和酶解时间的延长呈现出先升高后降低的趋势。这可能是由于酶解时间过长，温度升高使多肽水解成氨基酸，导致酶解液多肽含量降低。由图6可知，多肽含量随着酶底比和pH值增大而呈现出先升高后降低的趋势。这可能是因为蛋白酶相对浓度较高时，过碱性环境对蛋白酶活性抑制作用不明显。

由方程预测得到最佳酶解条件是酶解时间3.16 h，pH 9.48，酶解温度59.68℃，酶底比387.73 U/g，此时多肽含量为5.473 3 mg/mL。根据所得的分析数据进行3组重复验证试验，此条件下得到猪血酶解液中多肽含量为5.481 4 mg/mL，测定结果稳定，偏差不大，证明预测结果合理可靠。

2.3 不同分子量段猪血抗氧化肽体外抗氧化活性比较

猪血抗氧化肽粗提液经5、1 kDa超滤离心管超滤分级后，各分子量段抗氧化肽活性测定结果如表7所示。

表7 不同分子量抗氧化肽体外抗氧化活性的IC50值Table 7 IC50values of antioxidative peptides in different molecular weight

由表7可知，不同分子量段的猪血肽均具有抗氧化的能力，然而对不同的抗氧化指标表现出不同的抗氧化能力；不同分子量段猪血肽的同一抗氧化指标也不相同，分子量在0～1 kDa的肽段的抗氧化指标的IC50最小，说明高活性的猪血抗氧化肽分子量集中在1 kDa以下。

3 结论与讨论

3.1 讨论

目前，酶解法和发酵法制备活性多肽的工艺比较流行[5]。从本质上讲，两种方法都是利用蛋白酶的酶解作用产生目的肽段，但又各有不足。采用菌酶联合制备方式，可降低商业酶的使用量[6]，同时弥补微生物发酵水解程度低的不足。本试验采用菌酶联合制备猪血抗氧化低聚肽，可使发酵液多肽含量从2.31 mg/mL显著提高到5.48 mg/mL[1]。

抗氧化肽的抗氧化活性由其相对分子质量、肽段的氨基酸组成序列和空间构造决定。分离纯化单一的抗氧化活性肽不仅成本较高，且产量较低，有研究证明低聚肽内部可能发生协同效应[15]，因此，本试验研究了不同分子量段的猪血低聚肽的抗氧化活性，结果证明0～1 kDa猪血低聚肽的抗氧化活性优于其他分子量段的猪血低聚肽，这与杜欣[6]研究结果相似，可能是因为只有当肽达到适当的分子量时，这些供氢基团才能得到最大的暴露与自由基作用而发挥抗氧化作用[16]，但具体的作用机制与抗氧化活性的关系还有待在后续研究中进一步探讨。

3.2 结论

通过单因素试验和响应面法优化得到菌酶联合制备猪血抗氧化低聚肽的最优工艺条件为：底物浓度59.0 g/L，发酵时间 56.5 h，接种量 3.22∶100（体积比）此时多肽含量为2.31 mg/mL，·OH清除率为78.94%；酶解时间 3.0 h、pH 9.5、酶解温度 60 ℃、酶底比 390 U/g[2]，此条件下制备得到酶解液多肽含量5.48 mg/mL，多肽含量较单一发酵提高2.39倍，·OH清除率为93.62%。

采用超滤法分离得到分子量为0～1 kDa、1 kDa～5 kDa和0～5 kDa的猪血抗氧化低聚肽，采用·OH清除率、·O2-清除能力，抑制脂质过氧化能力、还原力、ABTS＋·清除率、DPPH·清除率、总抗氧化力7种体外抗氧化指标比较3种不同分子量段的猪血低聚肽的抗氧化活性，结果表明：3种不同分子量段抗氧化肽活性大小为 0～1 kDa＞ 0～5 kDa＞ 1 kDa～5 kDa，说明高活性的猪血抗氧化肽分子量集中在1 kDa以下。