红姑娘茎叶总黄酮提取及体外抗氧化活性研究

姜秀娟，吴威，张雅婷，孙娜，曹柏营

（1.吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林长春130052；2.长春职业技术学院食品与生物技术分院，吉林长春130033）

红姑娘（Physalis alkekengi）属多年生茄科植物，别名酸浆、灯笼草[1-3]。红姑娘药食兼用，即可生食，又可入药[4]，在《本草纲目》中记载了红姑娘有止咳、名目和清热解毒等功效[5]。红姑娘含有丰富的黄酮类化合物[6-7]，植物黄酮类化合物是一种天然强抗氧化剂，不但对自由基的清除能力强，而且有降血压、降血糖、抗肿瘤和抑菌等作用[8-11]。因此，植物黄酮化合物已经成为近几年关注的热点。

红姑娘主要产于东北地区，特别是长白山的红姑娘品质甚好，但红姑娘的开发利用率很低[12]。国内对红姑娘的研究大部分集中在红姑娘酸奶、饮料以及果酒等方面[13-16]，关于附加值较高的植物黄酮类化合物的文献报道较少，未见红姑娘茎叶黄酮化合物的研究报道，以长白山野生红姑娘茎叶为原料，研究总黄酮提取的最佳工艺，评价精制后的总黄酮的抗氧化活性，为红姑娘资源的精深加工及长白山野生资源的开发利用提供重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

红姑娘茎叶：采自长白山山区，自然晾干，试验前用烘箱（60℃～70℃）干燥后粉碎、过80目筛子备用。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

UV-2102C型紫外可见光分光光度计：深圳市凯铭杰仪器设备有限公司；AL104型分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HH-4型数显控温水浴锅：江苏省金坛市友联仪器研究所；CS-700Y型多功能粉碎机：永康市天祺盛世工贸有限公司；ZD-2自动电位滴定仪：上海仪电科学仪器股份有限公司；RE-52C型旋转蒸发仪：巩义市予华仪器有限责任公司；ALPHA 1-4 LD PLUS型真空冷冻干燥机：德国Marin Christ公司。

1.2.2 试剂

DPPH：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；芦丁标准品：中国食品药品检定研究院；AB-8型大孔吸附树脂：天津允开树脂科技有限公司；硝酸铝、亚硝酸钠、三羟甲基氨基甲烷[Tris（Hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、氯化铁、邻苯三酚、乙醇、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯甲烷、冰醋酸、硫代硫酸钠等均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法测定总黄酮含量，以芦丁标准品绘制标准曲线[17]。标准曲线方程为：y=6.406 x+0.009（R2=0.999），芦丁标样浓度范围为0.006 4 mg/mL～0.044 8 mg/mL。标准曲线见图1。

图1 标准曲线Fig.1 Standard curve line

1.3.2 红姑娘茎叶总黄酮得率的测定

参照1.3.1中的标准曲线测定野生红姑娘茎叶总黄酮得率，总黄酮得率计算公式为：

式中：A为吸光度值；M为样品的质量，g；V为定容终体积，mL。

1.3.3 红姑娘茎叶总黄酮提取工艺优化

根据单因素试验结果，以影响野生红姑娘茎叶总黄酮得率的主要因素，即提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度为输入变量，以总黄酮的得率为试验指标，进行Box-Behnken中心组合设计试验。试验因素水平编码见表1。

表1 因素水平编码表Table 1 The levels of experimental factors

1.3.4 红姑娘茎叶总黄酮的精制

采用AB-8大孔树脂对野生红姑娘茎叶黄酮进行纯化精制，然后将处理过的树脂放入层析柱中（φ6.0cm×80cm），洗脱流速为2 mL/min，洗脱剂为70%乙醇水溶液，合并洗脱液减压蒸馏，冻干备用。

1.3.5 红姑娘茎叶总黄酮的体外抗氧化活性测定

将精制红姑娘茎叶总黄酮作为试验原料，测定其体外抗氧化活性，其中对DPPH·的清除作用，参考林海桢[18]的测定方法；对O2-·的清除作用，参考郑亚美[19]的试验方法；总还原能力的测定，参考王彦平[20]的试验方法；对·OH的清除作用，参考范艳丽[21]的试验方法。

1.3.6 数据处理

上述试验均重复进行3次，所得的试验结果采取平均值±标准差来表达，采用SPSS 19.0和Duncan法对实验数据进行分析与比较，Origin 8.5软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对红姑娘茎叶总黄酮得率的影响

乙醇浓度对红姑娘茎叶总黄酮得率的影响见图2。

图2 乙醇浓度对红姑娘茎叶总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids from stems and leaves of Physalis alkekengi

由图2可得，乙醇浓度在升高的同时红姑娘茎叶总黄酮得率也随之增加，乙醇浓度在80%时，总黄酮得率出现了最大值5.59 mg/g，说明此时的乙醇浓度与黄酮的极性关系非常密切，之后乙醇浓度继续增加总黄酮得率变化不显著（p＜0.05）。

2.1.2 提取温度对红姑娘茎叶总黄酮得率的影响

提取温度对总黄酮得率的影响见图3。

图3 提取温度对总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of temperature on the yield of total flavonoids from stems and leaves of Physalis alkekengi

由图3可以看出，红姑娘茎叶总黄酮得率随着提取温度的升高呈现先上升后下降的趋向，当提取温度达到70℃时，总黄酮的得率达到6.18 mg/g。高温条件下，黄酮类化合物的结构可能发生变化，导致总黄酮提取率降低。

2.1.3 提取时间对红姑娘茎叶总黄酮得率的影响

提取时间对总黄酮得率的影响见图4。

图4 提取时间对总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the yield of total flavonoids from stems and leaves of Physalis alkekengi

从图4可得，提取时间不断延长的同时，总黄酮得率在4 h之前呈直线上升，在4 h之后开始缓慢下降，所以在4 h时总黄酮得率最大为5.55 mg/g。如果提取时间过长，黄酮类化合物会出现损失，使得总黄酮得率减小。

2.1.4 料液比对红姑娘茎叶总黄酮得率的影响

料液比对总黄酮得率的影响见图5。

图5 料液比对总黄酮得率的影响Fig.5 Effect of liquid ratio on the yield of total flavonoids from stems and leaves of Physalis alkekengi

由图5可得，料液比为1∶30（g/mL）时，总黄酮得率最大为5.62 mg/g，料液比的增加提高了提取液中糖和叶绿素的含量，对总黄酮得率产生一定的影响，导致总黄酮得率降低。

2.2 响应面试验方案及结果

2.2.1 响应模型的建立

试验方案及试验结果见表2，响应面回归模型方差分析见表3。

表2 试验方案及试验结果Table 2 The experimental design and results

表3 响应面回归模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

Design Expert 8.06软件对表2中的试验结果进行回归分析，结果如表3所示，由此得到回归模型方程为：Y=6.208+0.071A-0.041B-0.014C-0.034D-0.155AB-0.088AC+0.085AD+0.34BC+0.173BD-0.07CD-0.296A2-0301B2-0.299C2-0.124D2。

由表3可见，野生红姑娘茎叶黄酮提取的响应面模型极为显著（p＜0.000 1），模型的相关系数R2=0.962 9，通过调整负相关系数R2Adj=0.925 9，方程失拟项不显著（p=0.062＞0.05），综合分析表明，使用该模型可以分析和预测从红姑娘茎叶中提取总黄酮的过程。

方差分析结果表示，一次项A，交互项AB、BC、BD，二次项 A2、B2、C2、D2都对响应值产生了极为显著的影响（p＜0.01）；其中AC、AD的交互作用也分别对响应值产生了明显影响（p＜0.05）；各试验因素对总黄酮得率的影响顺序为A＞B＞D＞C，即乙醇体积分数＞提取温度＞料液比＞提取时间。

2.2.2 响应曲面分析

响应曲面和等高线见图6。

由图 6可得，乙醇浓度（A）和提取温度（B）（图6a）、乙醇浓度（A）和提取时间（C）（图 6b）、乙醇浓度（A）和料液比（D）（图 6c）、提取温度（B）和提取时间（C）（图 6d）、提取温度（B）和料液比（D）（图 6e）的响应曲面图都呈现中间高，两端低的趋势，等高线呈现椭圆形，表明在试验因素水平变化范围内，响应值具有最大值，试验因素间的交互作用显著。

2.2.3 最优工艺条件确定与验证

经响应面软件分析后，得到了野生红姑娘茎叶黄酮的最佳提取工艺条件如下：乙醇浓度71.9%，提取温度 67.1℃，提取时间 3.81 h，料液比 1 ∶27.8（g/mL），红姑娘茎叶总黄酮得率的理论值可达到6.28 mg/g。修正后红姑娘茎叶总黄酮提取最优工艺如下：乙醇浓度72%，提取温度 67℃，时间 3.8 h，料液比 1∶28（g/mL），采用最优工艺条件重复5次验证试验，最终得到的野生红姑娘茎叶总黄酮的平均得率为（6.35±0.23）mg/g，与预测理论值相接近。

2.3 红姑娘茎叶总黄酮精制

红姑娘茎叶黄酮的精制选用AB-8大孔树脂柱层析法，树脂吸附饱和后，以70%乙醇水溶液为洗脱剂，按2 mL/min的流速洗脱树脂，每3分钟收集一个试管，测定黄酮含量，绘制黄酮洗脱曲线如图7所示，红姑娘茎叶黄酮洗脱曲线中出现一个大峰，从48 min开始至93 min结束，因此收集48 min～93 min的黄酮洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥后，测定红姑娘茎叶总黄酮纯度达到（39.16±0.47）%。

图6 响应曲面和等高线Fig.6 Response surfaces and contour plots

图7 红姑娘茎叶黄酮洗脱曲线Fig.7 Desorption curve of total falvonoids from stems and leaves of Physalis alkekengi

2.4 红姑娘茎叶总黄酮体外抗氧化活性的研究

红姑娘茎叶总黄酮对DPPH·、超氧阴离子和羟自由基的清除作用及总还原力见图8。

图8 红姑娘茎叶总黄酮对DPPH·、超氧阴离子和羟自由基的清除作用及总还原力Fig.8 DPPH·，superoxide anion,hydroxyl radical scavenging activities and reducing power of total falvonoids from stems and leaves of Physalis alkekengi

由图8可得，随着野生红姑娘茎叶总黄酮浓度的增加，DPPH·清除率也随之增加，当总黄酮浓度达到600 μg/mL时，清除率达到100%，其DPPH·的清除率强于葡萄皮渣总黄酮[20]（400 μg/mL时清除率约70%）和无花果叶黄酮[23]（7 000 μg/mL时清除率约66.7%）；对O2-·的清除率在总黄酮浓度为800 μg/mL时达到了最大值98.57%，其清除能力强于红树莓籽黄酮[24]（1 600 μg/mL时清除率约80%）；对·OH的清除率在总黄酮浓度为800 μg/mL时达到了最大值91.53%，其清除能力强于八角茴香黄酮[25]（800 μg/mL时清除率约78%）；当总黄酮浓度为400 μg/mL时，总还原能力达到最大值，并表达出较强的还原力。野生红姑娘茎叶总黄酮对DPPH·、O2-·和·OH具有较强的清除效果，且存在一定的剂量效应作用，虽较对照VC的抗氧化能力略弱，但作为一种天然抗氧化剂，也表现出较强的抗氧化活性。

3 结论

采用响应面法优化后的红姑娘茎叶总黄酮提取最优条件为：乙醇浓度 72%，料液比 1 ∶28（g/mL），温度67℃，时间3.8 h，总黄酮得率最高为6.35 mg/g，纯化精制后的总黄酮纯度达到39.16%。体外抗氧化活性研究表明，野生红姑娘茎叶总黄酮对DPPH·、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率分别达到100%、98.57%和91.53%，同时还原力也比较强。野生红姑娘茎叶总黄酮具有较强的体外抗氧化活性，关于野生红姑娘茎叶总黄酮的体内抗氧化活性及机理的研究将在后续课题研究中进行探讨。