苏云金芽孢杆菌发酵上清液抑菌谱及稳定性

贾淑颖， 郝再彬， 陈圣怡， 韩兵兵， 李 霞

（桂林理工大学 化学与生物工程学院，广西 桂林 541004）

苏云金芽孢杆菌 （Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种天然革兰氏阳性昆虫病原细菌，生长代谢过程中产生的晶体蛋白对多种害虫有特异毒杀作用，是目前最广泛的微生物杀虫剂[1]。Bt的抗菌防病机制是通过产生抗菌物质抑制病原生长或直接杀灭病原。Bt产生的拮抗物质主要有抗生素、细胞壁降解酶类、细菌素和其它抗菌蛋白及挥发性抗菌物质等，其中抗生素包括多肽抗生素、脂肽抗生素和次生代谢产生的其它抗菌活性物质等。近几年，国内研究多数是在杀虫方面，Bt以色列亚种开发的灭蚊制剂、防治储粮害虫的Bt杀虫剂已投放市场[2]，对仓储烟草害虫、松材线虫病的研究也在进行[7-8]。也有研究表明，该抑菌物质对苹果轮纹菌（Dothiorella gregaria）、苹果褐斑病菌（Marssonin mali）、尖孢镰刀菌 （Fusarium oxysporum）、白菜黑斑菌（Alternaria brassicae）等植物病害微生物有明显的抑菌作用[3]。

作者选取Bt185和HD-1菌株对它们的发酵液抑菌谱和稳定性进行研究，为发酵液的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）Bt185、HD-1 以 及 草 生 欧 文 氏 杆 菌LS005（Erwinia herbicol）供试菌：由中国农业科学院植物保护研究所提供；大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、普通变形球菌（Proteus vulgaris Hauser）、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）、乙型副伤寒杆菌 （Bacillus paratyphosus B）、绿脓杆菌（Bacillus aeruginosus）：由桂林医学院提供。

1.1.2 试剂 石油醚、正丁醇、三氯甲烷、四氯化碳、乙酸乙酯、异戊醇、葡萄糖、NaCl、MnSO4·H2O、K2HPO4、MgSO4等试剂：均为分析纯；蛋白胨、酵母粉：英国OXOID公司；琼脂：北京索莱宝科技有限公司；牛肉膏：上海蓝季生物。

1.1.3 主要设备 RE-52A I型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；KQ-400型高功率数控声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；CL-5-B离心机：上海安亭科学仪器厂；LRH-150-Z振荡培养箱：珠江医疗器械。

1.1.4 培养基 1/2 LB固体培养基 （g/L）：蛋白胨5，酵母粉2.5，氯化钠 5，琼脂粉15。发酵培养基（g/L）：葡萄糖 20，蛋白胨 20，无水氯化钙 0.8，K2HPO41.3，MgSO40.2，MnSO4·H2O 0.8。调节 pH 至 7.0～7.2，封口灭菌备用。

抑菌培养基（g/L）：牛肉膏3、蛋白胨10、氯化钠5、琼脂 15。

1.2 方法

1.2.1 发酵液预处理 将甘油管保存的Bt185、HD-1菌株分别接入灭好菌的1/2 LB液体培养基中（约 10 μL），30 ℃下培养 8～12 h（OD600＞0.8），为种子液。

将上述种子液分别按体积分数5%接入灭好菌的发酵培养基中，30℃振荡发酵48～50 h。

发酵液4 500 r/min离心15 min，取上清液，浓缩10倍。

1.2.2 抗菌谱 采用牛津杯法测定发酵液对供试菌的抑菌活性。将供试菌种子液按5%的接种体积分数加入抑菌培养基中，将处理后的发酵液150 μL加入到牛津杯孔中，按供试菌的适宜温度放入相应温度的培养箱中培养12 h，测量抑菌圈直径。牛津杯：内径（6±0.1）mm、外径（8±0.1）mm、高（10±0.1）mm的圆筒形小管。

1.2.3 发酵液稳定性测定

1）发酵液热处理：取适量处理后的发酵液分成10等分，分别在4℃冰箱、室温约20℃（对照）、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃温度梯度下恒温 2 h，分别测定抑菌圈（草生欧文氏杆菌）大小。

2）发酵液酸碱处理：取适量处理后的发酵液分成 9 等分，分别调 pH 3、4、5、6、自然 pH 约为 7（对照）、8、9、10、11，2 h 后调回自然 pH，分别测定抑菌圈（草生欧文氏杆菌）大小。

3）发酵液超声处理：取适量处理后的发酵液分成10等分，在温度40℃，功率360 W超声条件下，分别超声 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 h，分别测定抑菌圈（草生欧文氏杆菌）大小。

4）发酵液紫外处理：取适量处理后的发酵液分成 10 等分，放在 20 W 紫外灯下 15、30、45、60、75、90、105、120、135、150 min，分别测定抑菌圈（草生欧文氏杆菌）大小。

1.2.4 有机试剂萃取 将发酵液浓缩液分成6等分（对照为原液），分别加入等量的萃取剂，反复振荡混合，于4℃冰箱静置分层或离心分层，分别测定水相、有机相、原有机试剂及原液的抑菌圈大小。以草生欧文氏杆菌为供试菌。

选用的萃取剂（极性大小顺序）：异戊醇＞三氯甲烷＞乙酸乙酯＞正丁醇＞四氯化碳＞石油醚。

2 结果与分析

2.1 抗菌谱的测定

通过比较发酵上清液对9种供试菌抑菌性发现，草生欧文氏杆菌抑菌最明显，其次是普通变形球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，对比发酵液稳定性时，采用草生欧文氏杆菌，见表1。

表1 供试菌的最适温度及发酵上清液对9种指示菌抑菌圈直径测定Table 1 Optimal temperature for test bacteria and the diameter of inhibition zone of 9 kinds of indicator bacteria concentration of fermentation broth

2.2 不同浓度发酵上清液的抑菌效果

由表2可看出：发酵液的浓度越高，抑菌能力越强。

表2 不同浓度发酵液的抑菌圈直径Table 2 Diameter of inhibition zone ofdifferent concentration of fermentation liquid

2.3 发酵上清液稳定性

2.3.1 温度对发酵上清液稳定性的影响 由图1可知，Bt185和HD-1发酵上清液均具有较高的热稳定性，50℃以上，抑菌圈明显变小，即抑菌物质逐渐失活，80℃以上，几乎没有抑菌。以上实验结果说明，Bt185和HD-1发酵上清液在低于50℃时，热稳定性较好。

图1 发酵液温度稳定性Fig.1 Fermentation liquid temperature stability

2.3.2 pH对发酵上清液稳定性的影响 由图2可见，在酸性环境中，发酵上清液的抑菌活性较稳定；在碱性环境中，抑菌活性有明显下降，当发酵上清液pH=10时，几乎没有抑菌活性，将发酵上清液调回pH＜9时，抑菌物质失活，没有抑菌性。由此可以得出在发酵上清液处理时，应该保持在pH 3～9的条件。

图2 发酵液酸碱稳定性Fig.2 Fermentation liquid acid-base stability

2.3.3 超声作用对发酵上清液的影响 由图3可见，在超声波不断刺激的条件下，Bt185菌株和HD-1菌株发酵上清液的抑菌活性下降，说明Bt185和HD-1发酵上清液在超声波的条件下稳定性较差，在连续超声3.5 h后，发酵上清液对草生欧文氏杆菌几乎没有抑制性。

图3 发酵液超声稳定性Fig.3 Fermentation liquid ultrasonic stability

2.3.4 紫外光照对发酵上清液稳定性的影响 由图4可见，Bt185和HD-1发酵上清液对紫外光具有较好的稳定性，经过紫外光连续照射150 min，发酵上清液仍有较高的抑菌活性。

图4 发酵液紫外光照射稳定性Fig.4 Fermentation liquid UV irradiation stability

2.4 有机试剂萃取

由表3可看出，Bt185发酵上清原液石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、三氯甲烷的萃余相的抑制圈直径明显比萃取相都大，与原液相比就不是很明显。原液的抑菌圈直径比四氯化碳和异戊醇萃取相及萃余相都明显大。因此可得知Bt185发酵液的大多数抑菌活性物质为弱极性物质。

表3 发酵上清液萃取后各相的抑菌圈直径Table 3 Inhibition zone diameter of each phase after extraction of fermentation broth mm

HD-1发酵液原液的抑菌性明显比萃取相和萃余相的抑菌性大，其中石油醚、四氯化碳、正丁醇、三氯甲烷和异戊醇的萃余相的抑制圈直径比萃取相都大，而乙酸乙酯的萃取相的抑制圈明显比萃余相大。因此可得知HD-1发酵液的大多数抑菌活性物质为极性物质。

3 结语

通过本研究发现，Bt185、HD-1菌株发酵上清液抑菌活性均具有进一步研究开发的价值。发酵上清液对种供试细菌均有不同程度的抑制作用，对草生欧文氏杆菌的抑制作用最强。为了得到高浓度的抑菌活性物质，应该浓缩更高的倍数，然后进一步纯化得到纯品。

Bt185、HD-1菌株发酵液稳定性研究表明，避免高温处理；适宜的pH范围较广但不耐碱；连续超声的条件下，时间要控制在2 h内，抑菌物质才不易被破坏；紫外照射条件下影响不大，活性成分较为稳定。Bt185菌株发酵液的抑菌性物质为弱极性物质，可以随着萃取试剂萃取出来，而HD-1菌株发酵液的抑菌性物质为极性物质，不易萃取，下一步需验证不同菌株产生的抑菌物质是否为同一种结构。Bt185菌株的各项稳定性都要优于HD-1菌株，工业化生产中有一定的优势。