高产铁载体产生菌的筛选及其在发酵绿茶中的初步应用

李韵雅 ， 曹刚刚 ， 蔡宇杰 ， 廖祥儒 *

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学生物工程学院，江苏无锡214122）

茶含丰富营养物质，具多种保健功能，是一种广泛适用的饮品。茶叶中研究最多的几种生物活性成分有茶多酚 （tea polyphenol）、 茶多糖（tea polysaccharide）和咖啡碱（caffeine）。 茶多酚是包括黄烷醇类、黄烷酮类、花色苷类和酚酸类等在内的约30多种含酚基的物质；黄烷醇类是茶多酚的主要存在形式，而儿茶素类化合物是黄烷醇类的主要成员，因此在茶叶中茶多酚大部分都以儿茶素的形式存在[1]。茶多酚不仅是一种天然的抗氧化剂，还具有免疫调节、抗癌抗突变、抗动脉粥样硬化、抗辐射、防止糖尿病等广泛的生理功能。茶多糖主要包括葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、核糖、半乳糖、木糖及甘露糖等。茶多糖是一种水溶性复合多糖，相对分子质量约为 l×l04～5×104，茶叶中提取的茶多糖产品常含有少量的蛋白质、果胶等物质[2]。茶多糖具有抗血栓、增强免疫功能、降血糖、降血脂、抗凝血等多种生物活性。茶叶中咖啡碱含量约占干物质量的2%～5%[3]。咖啡碱能兴奋中枢神经系统，还可以起到解热镇痛、助消化、利尿的作用，广泛应用于医药、食品和化工行业。

虽然茶叶中这些物质功能多样，但是摄入过多则对健康不利，如茶多酚摄入过多会刺激胃部。发酵过程中茶多酚被氧化，茶叶本身的酚氨比降低、芳香物质增加，同时酚氨比的降低也可以增强茶汤口感的协调性[4]。经过不同微生物发酵还可以改善茶的口感或风味，做成不同品种的发酵茶。细菌、霉菌和食用菌都可以应用于茶叶的发酵。在普洱茶研究中发现接种有益菌进行茶叶发酵有利于茶叶优良品质及特定风味的形成[5-8]。也有研究人员采用多菌种混合发酵和不同菌种分阶段发酵的工艺。胡燕等[9]以茶叶浸提液为主要基质，对用乳酸菌发酵茶饮料的加工工艺进行优化，在工艺条件优化后制得的茶饮料，既有茶的各种风味物质和营养成分，又增加了酸奶的营养成分，使其风味好、品质佳。江洁等[10]采用乳酸菌和酵母菌进行两段发酵，发酵后茶汤既有乳酸菌饮料的风味和保健特征，又具酵母发酵的醇香。日本的发酵茶也是一种混菌多菌种分段发酵的茶饮料，其生产工艺是在茶饮料中先接种Aspergilus fumigatus，Aspergillus nigerm，Penicillium sp.，Seopulariopsis brcvicaulis， 发酵一段时间后，茶叶基质中纤维素和果胶等被消化破坏，茶中营养物质易溶出，再接种Laetobacillus plantarum，继续发酵，即制成了一种氨基酸含量较高的发酵茶饮料[11]。

当处于低铁胁迫环境时，为了满足微生物生长对铁的需求，微生物能够分泌铁载体用以形成铁螯合物，以有效吸收自然中溶解度很低的铁[12]。铁载体类型主要为氧肟酸盐型（hydroxamates）、儿茶酚盐型（phenolatescatecholates） 和羧酸盐型（carboxylates）等。临床上，铁载体可用于铁中毒或作为毒力因子治疗细菌疾病，还能够与抗生素结合形成共轭化合物，从而将抗生素传递给细菌细胞[13-15]。铁载体可以改善人体对铁的吸收，在健康保健方面具有广泛的应用前景。

作者研究的目的是筛选铁载体高产菌株，并将其应用到绿茶发酵，在实现常用的茶叶发酵菌株的改善茶叶品质的效果的同时提高发酵茶的营养价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器设备

1.1.1 主要材料 茶叶：市售低档绿茶；菌种：作者所在实验室保存的苏铁根际芽孢杆菌。

1.1.2 主要试剂 CAS（铬天青），FeCl3，CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），亚硝酸钠，钼酸钠，2,3-二羟基苯甲酸，NaOH，HCl等试剂：购自国药集团;API 50CHB鉴定试剂条：购自生物梅里埃有限公司;细菌基因提取试剂盒：购自宝生物工程有限公司。

1.1.3 培养基 斜面培养基（g/L）：胰蛋白胨10.0，酵母膏 5.0，NaCl 10.0，琼脂 15.0；pH 7.0。

CAS双层平板：下层10 mL CAS-Fe3+-CTAB固体检测液，CAS浓度为 1 mmol/L，Fe3+浓度为 0.1mmol/L，CTAB 浓度为 4 mmol/L，琼脂 20 g/L；上层10 mL固体LB培养基。

LB 培养基（g/L）：胰蛋白胨 10.0，酵母膏 5.0，NaCl 10.0：pH 7.0。

KMB 培养基（g/L）：甘油 9.0 mL，K2HPO42.5，MgSO4·7H2O 2.5，酪蛋白氨基酸 5.5；pH 自然。

以上培养基均经过115℃灭菌20 min。

1.2 分析方法

1.2.1 菌种鉴定 采用16S rRNA基因序列分析法，按试剂盒说明提取细菌DNA并以通用引物F27（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ） 和 R1492（5’-TACGGCTACCTTGTTA CG ACTT-3’ ）扩增细菌16S rRNA基因，纯化测序。

1.2.2 铁载体类型鉴定铁载体类型鉴定 主要根据螯合铁离子集团的不同及其与不同试剂的不同显色进行鉴定[16]。

1）高氯酸铁实验：取发酵上清液0.5 mL加入2.5 mL的高氯酸铁溶液，若颜色变成红色或者橙色，则说明发酵上清液中含有异羟肟酸类铁载体。

2）FeCl3实验：取发酵上清液1 mL加入1～5 mL 2 g/L的FeCl3溶液，如果颜色变红或变紫说明有铁载体的存在。1 mL上清液加入1 mL FeCl3溶液立即变红的，则为异羟肟酸类铁载体，1 mL上清液加入多于1 mL FeCl3溶液，溶液变红或变紫，则为儿茶酚类铁载体。

3）Arnow实验：取发酵上清液1 mL，依次加入1 mL 0.5 mol/L盐酸，1 mL钼酸盐溶液，若上清液中存在儿茶酚型铁载体，则溶液中的亚销酸分解，生成黄色NO配体，溶液颜色变黄。

钼酸盐溶液配制：称取硝酸钠10 g与钼酸钠10 g溶解于100 mL蒸馏水中。

因为亚硝酸在溶液中的分解迅速不利于黄色配体的生成，因此，在溶液中加入钼酸钠，可使亚硝酸分解减慢。钼酸钠加入后还可提高显色的亮度达15倍。

加入1 mol/L的氢氧化钠溶液1 mL，若含有儿茶酚类铁载体，则颜色变红，而且至少能够保持一个小时不变色。

1.2.3 铁载体浓度测定 实验方法依据参考文献［16］采用Arnow实验进行定量，方法略有改动。

标准曲线绘制：配置1 mmol/L的2，3-二羟基苯甲酸溶液。将其分别稀释使浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L。 取上述各浓度梯度的2，3-二羟基苯甲酸溶液1 mL于试管中，依次加入1 mL 0.5 mol/L盐酸，1 mL 1 mol/L钼酸钠溶液，1 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液，混合均匀，静置1 h，检测OD515。

取1 mL发酵上清液，加入1 mL 0.5 mol/L盐酸，1 mL 1 mol/L钼酸钠，1 mL 1 mol/L氢氧化钠，混合均匀，静置1 h，检测OD515。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种筛选 CAS平板初筛：将实验室保存的69株苏铁根际芽孢杆菌分别接种到LB平板，30℃培养3 d。挑取菌落接种到CAS双层平板，继续在30℃培养3 d。

铁载体高产株筛选：选取CAS双层平板中变色圈大的菌株作为初筛菌株，接种到LB培养基中30℃培养3 d得到种子液。按体积分数1%接种种子液至50 mL KMB培养基中，30℃、200 r/min培养3 d。离心得到上清液。再用Aronw实验测定铁载体的浓度。选取产高铁载体的菌株接种斜面保存。

1.3.2 茶叶的品鉴 茶叶的感官评价根据国家标准GB/T 23776-2009《茶叶感官审评方法》中普通（大宗）绿茶的评审方法执行。茶的品鉴得分根据下式（1）计算得出（单项满分100分）：

式中，A1为外形得分，A2为汤色得分，A3为香气得分，A4为滋味得分，A5为叶底得分。

1.3.3 绿茶发酵条件优化 发酵温度与时间是影响发酵茶品质的主要因素[17-18]，而本实验中菌种为新的外加菌种，所以选取温度、接种量和时间3个条件进行优化。

发酵温度和接种量：每瓶放入5 g茶叶，选取发酵温度和接种量2个因素做正交实验，因素和水平见表1，发酵7 d后进行感官评价。

发酵时间的优化：取5 g绿茶，接种2.5 mL种子液后于40℃培养7～13 d，品鉴茶叶。

表1 L9（32）正交优化设计因素水平表Table 1 Orthogonal design

2 结果与分析

2.1 菌种筛选和鉴定

2.1.1 CAS双层平板初筛 铁载体结合CAS-Fe3+-CTAB蓝色复合物中的Fe3+，复合物解体平板显现出CAS原有的黄色[19]。故可根据平板变色圈的大小判断菌株是否产生及产铁载体能力的强弱。取自苏铁根部的土壤涂板得到69株菌，接种69株菌到CAS平板，得到8个能够产生铁载体的菌株，编号分别为：11，15，36，50，86，142，168，169，见图 1。

2.1.2 初筛菌种产铁载体类型鉴定 初筛得到的8株菌的铁载体类型检测结果见表2，可知其主要产生的铁载体类型为儿茶酚盐型。

2.1.3 茶叶发酵初试及产铁载体能力检测 上述8个菌株接种种子液到茶叶进行固态发酵，然后对发酵茶进行感官评审；接种菌株到KMB培养基发酵后测定铁载体浓度，结果见表3。

图1 CAS双层平板初筛结果Fig.1 Isolation of strains on CAS plates

表2 铁载体类型检测结果Table 2 Siderophore type test results

表3 初筛菌株茶叶发酵初试结果及产铁载体能力检测结果Table 3 Tea fermentation test and produce siderophores test results of the frist screenedStrains

品鉴不同菌株发酵后茶叶的品质，得到15、36、142、169四株菌发酵后茶叶品质较好，都在70分以上。36、169两株菌铁载体产量较高。综合不同菌株发酵后茶叶感官和铁载体产量，选取36号菌为后续实验菌株。

2.1.4 菌种鉴定 16S rRNA基因鉴定，将测得序列进行BLAST比对，根据结果，取序列相似度较高的模式菌株，使用Clustalx1.81和MEGA 4.0.2软件采用邻接法（Neighbor-Joining method）进行聚类分析和系统进化树构建，结果见图2。目的菌株36的16S rRNA基因序列与芽孢杆菌属特基拉细菌的16S rRNA基因序列最为接近。

菌36平板菌落形态如图3所示，其菌落较小，白色不透明，边缘光滑，表面呈伞状凸起，较粘稠、易挑取。目的菌糖发酵生理生化鉴定见表4。目的菌初步鉴定为细菌界、硬（或厚）壁菌门、芽孢杆菌纲、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、特基拉芽孢杆菌属。

图2 基于16S rRNA基因序列对目的菌株构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of the target strain based on its 16S rRNA gene analysis

图3 目的菌平板菌落形态Fig.3 Colony morphology on plate of the target strain

2.2 绿茶发酵优化

2.2.1 发酵温度和接种量 茶叶发酵温度和接种量的正交实验结果见表5。可知，温度对茶叶感官的影响大于接种量。接种量加大时细菌发酵产生的酸臭味增加，但这种酸臭味在干燥过后并不明显。温度升高可去除茶叶中部分杂味，但高温长时间发酵有可能给茶叶带来焦糊味，影响茶叶香气和口感。此次优化实验得到发酵温度40℃、接种量0.5 mL/g时发酵茶感官评价最高。发酵后茶汤苦涩味减少，口感协调性增加。

表4 API 50 CHB试剂盒对应底物及目的菌反应Table 4 The substrates corresponding to API 50 CHB kits and the strain reaction

表5 茶叶发酵温度与接种量正交实验分析表Table 5 Orthogonal experiment analysis table of fermentation temperature and inoculum

2.2.2 发酵时间 发酵茶感官分数在第5天时最高，这时茶叶口感浑厚淳正，无苦涩味；香气怡人，杂味极少；色泽红亮澄清；叶底舒展较快，形状完整。茶汤中铁载体浓度因为发酵过程中多酚类物质的降解而降低。

图4 不同发酵时间茶叶指标Fig.4 Indicator diagram of tea with different fermented time

3 结语

“渥堆”发酵是熟茶（后发酵茶）加工的特定加工工艺，渥堆的实质是一个多种微生物参与的固态发酵过程，是茶品质形成的关键，微生物在其中起到极其重要的作用，目前采用专用菌曲生产熟茶已成为一种趋势[20]。本实验中，将筛选的一株特基拉芽孢杆菌应用到茶叶固态发酵，有效改善了茶叶的风味，尤其在茶叶香气方面，发酵后的茶获得了淡淡果香，且茶叶品质易再现。说明应用有益微生物进行可控发酵，可达到稳定茶叶品质形成独特风味的目的[21-22]。目的菌株具有分泌铁载体的功能，有报道显示铁载体在再灌注损伤、铁粒幼细胞贫血、铁过载心肌病等疾病的治疗和肝细胞保护等人体保健方面具有潜力[23-25]，但其对于发酵茶的保健效果是否增加仍需进一步验证。本研究中所用菌种是从苏铁根际菌中筛选得到的，属芽孢杆菌属。有研究证明多种芽孢杆菌在普洱茶发酵渥堆过程中起到至关重要的作用，也有将芽孢杆菌分离作为单菌种接种发酵茶[26-28]。虽然芽孢杆菌属细菌能广泛应用于食品工业中[29]，但本研究中发酵产品安全性仍有待进一步验证。

作者对目的菌株进行了16S rRNA和糖发酵生理生化指标的研究，初步鉴定该菌为芽孢杆菌属中的特基拉芽孢杆菌。在铁载体产量分析上，CAS试剂配制中加入的CTAB对菌体生长有抑制作用[30]，故作者采用的CAS双层平板使菌体利用上层LB培养基进行生长，而细菌所分泌的铁载体进入下层形成明显的变色圈，较参考文献[16]中的通用CAS平板更有利于对铁载体产量的判断。根据不同菌种生长需求常采用双层平板法或添加其他营养物质对通用CAS平板检测方法进行改进[31-32]。铁载体不仅可给产生菌自身提供可利用的铁源，过量的铁载体还能形成相对高铁浓度的小环境，有利于可利用同源铁载体的植物的生长，并抑制某些不能利用其铁载体的细菌（如病原菌）的生长[33-34]。由于铁载体也能螯合其他多种重金属，铁载体产生菌也常用来研究其对土壤改善的作用[35]。因此该菌种还具有被应用于植物促生、病原菌的防治及土壤改善等方面的潜力。