桑葚酒发酵期间花色苷及抗氧化活性变化

刘书晶， 吴彩娥， 范龚健， 李婷婷， 应瑞峰

（南京林业大学 轻工与食品学院，江苏 南京 210037）

桑葚，俗称桑果、乌葚和桑泡儿等，是桑科桑属多年生木本植物桑树的果实。我国桑葚资源丰富，已被国家卫生部列为“既是食品又是药品”的食品原料之一。桑葚不耐储存，采收后极易变质、失水，目前多被加工成桑葚果汁、桑葚酒和桑葚果酱等。桑葚酒是一种新兴的果酒，营养价值高，富含花色苷、黄酮、白藜芦醇等生物活性物质而被广泛研究[1]。目前已有关于桑葚酒发酵工艺优化[2]和香气成分分析[3]及发酵期间总花色苷的变化[4]的报道，但是还未见桑葚酒发酵期间花色苷种类和含量的变化规律研究。

随着花色苷的抗氧化[5]、抗肿瘤[6]和预防糖尿病[7]等生理活性被相继报道，花色苷越来越受到人们的关注。花色苷作为桑葚中的主要活性成分，对其加工产品的质量表征具有重要意义。目前桑葚酒主要采用葡萄酒酿制中常用的活性酿酒酵母进行发酵，但不同原料的成分差别较大，采用葡萄酒专用酿酒酵母不能更好地突出桑葚自身的特色[8]。自然发酵在红葡萄酒[9]和青梅酒[10]酿造中取得较好的效果。目前还未见桑葚酒自然发酵的研究报道。

为探明桑葚酒发酵期间花色苷和抗氧化活性的变化规律，作者通过测定发酵期间总酚、总花色苷和花色苷单体质量浓度，游离、聚合和辅色花色苷的质量浓度以及抗氧化活性等指标，并采用主成分分析对其进行综合评价，有助于促进桑葚酒优质化发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑葚：产自山东省潍坊市；1，1-二苯基-2-三硝基 苯 肼 （2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-联氮-二 （3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2，2'-Azinobis -（3 -ethylbenzthiazoline -6 -sulphonate），ABTS）、矢车菊-3-葡萄糖苷标准品（纯度≥95%），矢车菊-3-芸香糖苷标准品 （纯度≥98.0%）：美国 Sigma公司；三氟乙酸、乙腈（色谱纯）：美国Tedia公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UVmini-1240型紫外分光光度计：日本岛津公司；LHS-150HC-11型恒温恒湿培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；TG16-WS型台式高速离心机：长沙湘仪离心仪器有限公司；Waters2695液相色谱：美国Waters公司。

1.3 桑葚酒自然发酵

参照葡萄酒酿造工艺[11]制定了桑葚酒自然发酵的基本工艺。选择成熟度高、无腐烂的新鲜桑葚，破碎、打浆，放入2.5 L发酵瓶中，每瓶装2.0 kg桑葚（约2 L），调整SO2质量浓度至70 mg/L，加蔗糖调整成分至可溶性固形物含量为20°Brix，在18℃恒温箱中培养。主发酵期间每天对其进行 “打帽”处理，并取样测定相关指标；主发酵结束后，过滤酒液，进入后发酵，每隔3天测定相关指标。

1.4 测定指标

1.4.1 总酚 参照Fan等[12]的方法略有改动，总酚质量浓度以没食子酸为标准品，依据福林-肖卡法测定总酚。精确吸取离心后的桑葚酒200 μL，置于离心管中，加入已经稀释10倍的1.5 mL福林试剂，摇匀，加入1.5 mL质量浓度为75 g/L的Na2CO3溶液，充分混匀，暗处静置2 h，在紫外-可见分光光度计下，用10 mm比色皿，在725 nm波长下测定吸光值。结果以每毫升桑葚酒中含有相当于没食子酸的毫克数表示。

1.4.2 抗氧化活性 采用DPPH和ABTS两种体系测定桑葚酒自然发酵期间抗氧化活性的变化，参照杨道强等[13]的方法稍加改动。取200 μL稀释后的样品置于10 mL比色管中，加3 mL DPPH溶液，混匀静置30 min，利用紫外-可见分光光度计，在517 nm测定吸光值。取200 μL稀释后的样品，加3 mL ABTS溶液，在暗室反应30 min，利用紫外-可见分光光度计，在734 nm下测定吸光值。

以水溶性维生素E（Trolox）为参照物，结果以每毫升桑葚酒清除自由基能力相当于Trolox清除同等自由基的毫克数。

1.4.3 总花色苷 取离心后的桑葚酒200 μL，加5mL酸化乙醇，避光静置30 min，测定其530 nm处吸光度值，结果以矢车菊素-3-葡萄糖苷计[14]。

式中，MW为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量（449.2）；ε 为摩尔消光系数 （ε=26 900）；DF 为稀释倍数。

1.4.4 游离、辅色和聚合花色苷 参考Bimplias等[15]的方法略有改动，通过模拟酒（12%乙醇，5 g/L酒石酸，0.2 mol/L的NaCl，调整 pH值至 3.6）溶液将酒样稀释20倍，在520 nm处测定吸光值Awine。将20%乙醛40 μL加到4 mL的酒样中，静置45 min，在520 nm处测定待测液的吸光值A。将5%SO2320 μL加到4 mL的酒样中，在520 nm处测定待测液的吸光值ASO2。

1.4.5 色泽评价 参考Bimplias等[15]的方法并加以改进，未稀释的桑葚酒样品用1 mm比色皿分别在420、520、620 nm 处测定吸光值。

1.4.6 花色苷单体 桑葚酒过0.45 μm的滤膜，采用 XBridge-C18 柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），28 ℃进行HPLC分离，紫外检测器（Waters 2489）。进液量为20 μL，洗脱液为体积分数0.1%三氟乙酸（A）和乙腈（B），流速为0.8 mL/min，梯度洗脱。检测波长为520 nm，洗脱顺序见表1。以矢车菊-3-葡萄糖苷和矢车菊-3-芸香糖苷为标准品，精确称取花色苷单体标准品并配置成不同质量浓度的花色苷单体标准溶液，在520 nm处检测吸光度，并绘制标准曲线，计算花色苷单体质量浓度。

表1 桑葚酒花色苷洗脱顺序Table 1 Elution order of mulberrywine anthocyanins

1.5 数据分析

文中数据重复3次，结果以Mean±SD表示；用SPSS20.0进行显著性和主成分分析。

2 结果与讨论

2.1 桑葚酒发酵期间总酚质量浓度的变化

如表2所示，桑葚酒发酵期间总酚质量浓度变化差异显著（P＜0.05），这与赵红宇等[5]在桑葚全渣发酵过程中的结果一致，可能的原因是主发酵期间采用“打帽”方式，桑葚中的酚类物质不断溶出，导致桑葚酒总酚质量浓度升高。发酵第10天后，总酚质量浓度逐渐降低，至发酵终点变化趋于平缓，总酚质量浓度变化差异不显著（P＞0.05）。这可能是单宁类等物质聚合、酚类物质氧化作用、微生物产生的酶促使多酚类物质发生降解，多酚类物质的水溶性下降[16]，使桑葚酒中总酚的质量浓度呈下降趋势。此外，花色苷作为桑葚酒中主要的酚类物质，其质量浓度变化对桑葚酒总酚质量浓度也有较大的影响。

2.2 桑葚酒发酵期间抗氧化活性的变化

桑葚酒发酵期间清除DPPH自由基能力呈先升高后降低的趋势。桑葚酒在发酵第3天和第4天时清除DPPH自由基能力最大，比发酵起点和终点分别高0.79 mg/mL和0.54 mg/mL。桑葚酒发酵过程中，随着乙醇体积分数的增加，酒液中酚类物质溶出加快，其清除DPPH自由基能力提高。发酵后期桑葚酒清除DPPH自由基能力下降，这可能是由于桑葚酒中酚类物质受温度和pH值的影响而发生聚合和氧化反应[17]。此外，张晓松等[16]研究发现，植物细胞壁在微生物酶的作用下释放出蛋白质、多糖等成分，在一定程度上也会影响DPPH的清除能力。桑葚酒发酵期间清除ABTS自由基能力变化不规律。ABTS法反映的清除ABTS自由基的能力可与任何羟基化的芳香族化合物反应[18]，这就与DPPH法测定的抗氧化能力存在明显差异[19]。

表2 桑葚酒自然发酵期间总酚质量浓度及抗氧化活性变化Table 2 Changes of total phenolic content and antioxidant activity of mulberry wine during spontaneousfermentation

2.3 桑葚酒发酵期间总花色苷含量的变化

桑葚酒发酵期间总花色苷含量呈先升高后降低的趋势，见表3。发酵第2天达到最高值（530.29 mg/L），这是可能由于发酵过程中乙醇浸提作用造成的。发酵结束时，桑葚酒总花色苷质量浓度仅为最高点的32.87%。有研究表明，酵母在酒精发酵期间能产生β-葡萄糖苷酶能水解花色苷的糖苷键，这是导致总花色苷质量浓度下降的主要原因[14]。此外，酒精发酵过程中产生的丙酮酸和乙醛等小分子物质能与花色苷发生聚合生成吡喃花色苷[6]，这也有可能导致桑葚酒总花色苷质量浓度下降。

2.4 游离、辅色和聚合花色苷质量浓度的变化

桑葚酒发酵期间游离花色苷、辅色花色苷和聚合花色苷的比例变化显著。游离花色苷比例由87.53%下降到70.64%，辅色花色苷比例由9.70%下降到1.73%，聚合花色苷比例由3.63%增加到27.66%。韩富亮等[20]在对红葡萄酒的研究中发现，葡萄中的聚合花色苷虽然很少，但在发酵期间可促进聚合花色苷的形成，利于葡萄酒颜色的形成。桑葚酒发酵期间游离、辅色和聚合花色苷质量浓度的变化也体现了这一变化规律。

2.5 桑葚酒发酵期间色泽的变化

如表3所示，在整个发酵期间色度呈下降趋势，在发酵第14天达到最低值，为0.47，后发酵期间，色度趋于稳定。这表明桑葚酒发酵前期，显色物质的总量在减少，而发酵后期显色物质趋于稳定，这与发酵酒液中花色苷等呈色物质的消长规律有关[21]。一般花色苷质量浓度越高，酒颜色越深，色度越高[22]。色调的变化趋势与色度相反。色调反映各颜色之间的变化、转移情况。发酵过程中，色度的变化会对色调产生影响[21]。桑葚酒发酵过程中色调不断增加，说明酒液中显现黄色物质增加（A420）而显现红色物质减少（A520），这与李甜等[23]对紫薯酒发酵过程颜色变化规律的研究结果类似。

2.6 桑葚酒发酵期间花色苷单体比例的变化

经HPLC检测发现，桑葚酒中主要存在两种花色苷单体，见图1，其出峰时间与标准品矢车菊-3-葡萄糖苷和矢车菊-3-芸香糖苷一致。陈亮等[24]也证实了桑葚花色苷主要为矢车菊-3-葡萄糖苷和矢车菊-3-芸香糖苷。桑葚酒发酵过程中，矢车菊-3-葡萄糖苷和矢车菊-3-芸香糖苷质量浓度呈下降趋势，比初始发酵液（第0天）分别下降了86.84%和72.17%。何英霞等[11]研究认为，酵母在生长繁殖过程中会产生β-葡萄糖苷酶，该酶能将花色苷水解为花青素，而花青素在水溶液中稳定性差，易降解。此外，两种花色苷单体在发酵过程中降解速率存在较大差异，这是由于矢车菊-3-芸香糖苷的结构比矢车菊-3-葡萄糖苷复杂，极性小，不易受到水分子的攻击导致[6]。

图1 桑葚酒花色苷液相图谱Fig.1 HPLC chromatogram ofanthocyanins inmulberrywine

2.7 相关性分析

对桑葚酒自然发酵期间的11项指标进行相关性分析和显著性检验，见表4）。总花色苷质量浓度与游离花色苷比例、色度、矢车菊-3-葡萄糖苷、矢车菊-3-芸香糖糖苷质量浓度呈极显著正相关关系（P＜0.01），与聚合花色苷比例、色调呈极显著负相关关系（P＜0.01），聚合花色苷的比例与桑葚酒的色调有极显著的正相关性（P＜0.01），与色度有显著的负相关性（P＜0.05），说明花色苷的质量浓度和种类决定了桑葚酒的颜色性质；桑葚酒清除DPPH自由基能力与总酚质量浓度呈显著正相关（P＜0.05），说明酚类物质是桑葚酒中的主要抗氧化成分。

表3 桑葚酒自然发酵期间花色苷及色泽变化Table 3 Changes of anthocyanins and color of mulberry wine during spontaneous fermentation

表4 桑葚酒自然发酵期间各指标相关性分析Table 4 Correlation analysisof each index of mulberry wine during spontaneous fermentation

2.8 主成分分析

主成分分析是利用降维思想，通过描述性统计、差异性检验以及发酵过程的得分图、载荷图，把多个指标转化成少数几个相互独立且包含原来指标大部分信息的综合指标，通过研究指标体系的内在结构关系，使结果更具有客观性和准确性[25]。本研究中第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分别包含了原来信息量的61.77%和22.81%，为了以尽可能少的指标反映尽量多的信息，选取前两个因子作主成分，代表桑葚酒自然发酵主要的指标，见图2。

图2 不同成分因子载荷散点图Fig.2 Loadings plot of principal component analysis of different constituents

PC1主要综合了总花色苷、辅色花色苷、聚合花色苷、游离花色苷、色度、色调、矢车菊-3-葡萄糖苷、矢车菊-3-芸香糖苷的信息，其中聚合花色苷、色调在PC1上呈负向分布，其他呈正向分布，即在PC1坐标正向，PC1越大，聚合花色苷、色调取值则越小。PC2主要综合了总酚、DPPH、ABTS的信息，其中总酚、DPPH在第二主成分上呈负向分布，ABTS呈正向分布。变量与原点的距离反映其因子载荷，位于坐标轴原点远端的变量具有较大的因子载荷，位于原点近端的变量具有较小的因子载荷[25]。结合载荷散点图看，发酵第0天具有最大的因子载荷，含有较高的生物活性物质，清除DPPH、ABTS自由基的能力也显著，抗氧化活性高。发酵第8～10天聚为一类，生物活性物质含量低，抗氧化活性低。发酵第14-20天含有较高的总酚、清除DPPH、ABTS自由基的能力显著，见图3。利用主成分分析基本上反映了发酵期间桑葚酒花色苷质量浓度、色泽和抗氧化活性的贡献率，有效地揭示桑葚酒发酵期间花色苷、色泽和抗氧化活性的内在关系。

图3 桑葚酒公因子得分图Fig.3 Common scores scatter plot of mulberry wine

3 结 语

作者研究了桑葚酒自然发酵期间花色苷、色泽及抗氧化活性变化，并对结果进行了相关性和主成分分析，获得以下主要结论：桑葚酒发酵期间花色苷、色泽以及抗氧化活性等指标变化显著；酚类物质是桑葚酒中主要抗氧化成分，桑葚酒的色泽与花色苷的种类和质量浓度密切相关；对桑葚酒发酵期间的各指标进行主成分分析，提取得到两个主成分，其中PC1主要综合了桑葚酒的色泽以及花色苷组成与质量浓度相关信息，反映了桑葚酒发酵期间花色苷与色泽之间的变化规律；PC2主要综合了总酚质量浓度及抗氧化活性的相关信息，反映了桑葚酒发酵期间酚类物质抗氧化活性的变化规律。利用主成分分析有效地揭示桑葚酒发酵期间花色苷、色泽及抗氧化活性的变化规律，为更进一步开发高品质的桑葚酒提供了可行途径。