一株去除亚硝态氮细菌分离鉴定及特性研究

姚艳玲，袁春营，崔青曼，吕 军

( 1.松辽水环境科学研究所，吉林 长春 130021； 2.天津科技大学 海洋与环境学院，天津 300457 )

近年来，随着凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)集约化养殖的迅猛发展，水环境恶化和种质退化导致病害频发[1]，给养殖户造成巨大的经济损失，严重影响了对虾养殖业的健康稳定发展。益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定殖于宿主肠道内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。在凡纳滨对虾养殖水体中投入微生态制剂，可明显增强对虾血清的酚氧化酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶活性及抗菌活力和溶菌活力[2-4]。然而，目前用于对虾水质调控的微生态制剂以光合细菌、芽孢杆菌(Bacillus)、酵母菌和乳酸菌等为主[5]，针对水体亚硝态氮去除的微生物鲜有报道。

水产养殖动物的残余饵料、排泄物、死亡尸体等大量有机物在微生物的作用下，产生大量氨氮等含氮有害物质，氨氮在亚硝化细菌和光合细菌作用下转化成亚硝态氮，亚硝态氮进一步与胺类物质结合，形成具有强致癌作用的亚硝胺[6]。通常情况下，利用亚硝态氮的硝酸细菌为自养细菌，生长缓慢，造成亚硝态氮的快速积累，亚硝态氮的长期蓄积会直接导致鱼、虾等养殖对象抗病力的降低，引起各种病原菌的继发性侵袭，通常被视作是鱼、虾的致病根源[7]。因此，分离筛选去除亚硝态氮的异养硝酸细菌，并应用于水产养殖，对于快速降低养殖水体中的亚硝态氮，确保养殖动物健康生长，具有重要的实践意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株

试验菌株自天津汉沽养虾后期池水中分离纯化得到。

1.1.2 培养基

C4H6O43 g/L，NaNO20.32 g/L， Na2HPO4·12H2O 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，微量元素(EDTA 0.5 g/L，ZnSO4·7H2O 0.22 g/L，CaCl20.055 g/L，MnCl2·4H2O 0.051 g/L，FeSO4·7H2O 0.049 g/L，CuSO4·5H2O 0.0157 g/L，CoCl2·6H2O 0.016 g/L) 5 mL/L，pH 7.5。该培养基用于筛选和脱氮试验。

1.1.3 主要仪器

S.SW-CJ-1CU超净工作台(上海跃进医疗器械厂)，TGL-16高速冷冻离心机(湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司)，QYC-2102C立式双层小容量恒温培养振荡器(上海新苗医疗器械制造有限公司)，T1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，T100 PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)，ChemiDoc XRS型凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)，HT7700透射电子显微镜(日本日立公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离与筛选

500 mL锥形瓶中加入200 mL培养基，接入10 mL养殖水体，置于30 ℃恒温摇床中培养3 d。取富集培养的样品1 mL，用稀释梯度法依次稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度，从样品10-3梯度开始分别取0.1 mL 菌液，涂布于培养基平板上，生化培养箱30 ℃培养，24 h 后，挑取单个菌落，于相应的培养基平板上纯化培养。将纯化后的所有菌株分别接种于异养培养基中，170 r/min、30 ℃条件下培养，定期检测亚硝态氮含量(亚硝态氮测定采用重氮—偶氮法[8])，选择亚硝态氮去除效果最好的一株作为目的菌株，编号为LQ1。

1.2.2 菌株的鉴定

1.2.2.1 菌株的亚显微观察

菌株LQ1经过脱水、干燥、镀膜后用扫描电子显微镜观察。

1.2.2.2 菌株的部分生理生化特征

对分离筛选到的菌株按照《常见细菌系统鉴定手册》[9]方法进行葡萄糖、乳糖发酵，硝酸盐还原试验，甲基红试验，明胶液化试验，吲哚试验。

1.2.2.3 菌株的16S rDNA同源序列分析

按照Invitrogen 试剂盒说明书提取细菌DNA，细菌通用引物8F和1492R进行PCR扩增。引物上游8F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3′；下游1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR体系为50 μL，其中包括：5 μL 10×buffer，4 μL dNTPs，正反引物各1 μL，Taq 酶1 μL，DNA 模板1 μL，37 μL 无菌去离子水。扩增程序：94 ℃，预变性5 min;94 ℃，变性30 s，60 ℃，退火30 s，72 ℃延伸 2 min，进行30 个循环;最后72 ℃ 10 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，16S rDNA产物委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，利用BLAST软件，将测序结果与美国国立生物技术信息中心(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)中有关序列进行同源性分析。

1.2.3 最佳脱氮条件的筛选

1.2.3.1 碳氮比对菌株去除亚硝态氮的影响

改变培养基中NaNO2的含量，使其碳氮比分别为7、10、13、16、19、22、25，接入5%的菌株LQ1， 30 ℃，130 r/min的摇床中培养，6 h和12 h测定亚硝态氮含量。

1.2.3.2 初始pH值对菌株去除亚硝态氮的影响

分别将培养基的pH调至3、5、7、9、11，其他方法同1.2.3.1。

1.2.3.3 温度对菌株去除亚硝态氮的影响

培养基温度设置20、25、30、35、40、45 ℃ 6个梯度，其他方法同1.2.3.1。

1.2.3.4 脱氮率的计算

ρB/%=(ρ1-ρ2)/ρ2×100%

式中，ρB为脱氮率，ρ1初始亚硝态氮质量浓度；ρ2一定时间后亚硝态氮质量浓度。

1.3 数据处理与分析

所有试验数据均采用单因素方差分析。分析软件为SPSS 17.0，试验数据均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化

以亚硝态氮为唯一氮源的培养基，共筛选到6株去除亚硝态氮菌株，其中菌株LQ1去除效果最好。

2.2 菌株LQ1的形态与生理生化特征

2.2.1 菌株LQ1的形态

菌株LQ1在培养基平板上培养1 d，观察到菌落较小，灰白色，周边光滑圆润，表面规则；革兰氏染色阴性，细胞呈杆状，有鞭毛，大小为(2～3) μm×(0.5～1) μm(图1)。

2.2.2 生理生化特征

菌株LQ1的生理生化特征见表1，该菌株可以发酵葡萄糖和乳糖，还原硝酸盐，不能液化明胶，不产生吲哚，甲基红试验阴性。

图1 菌株LQ1的亚显微形态

鉴定指标葡萄糖发酵乳糖发酵硝酸盐还原甲基红试验明胶液化吲哚试验鉴定结果+++---

2.3 菌株LQ1的16S rDNA序列分析

菌株LQ1经PCR扩增，扩增产物的琼脂糖电泳结果见图2，16S rDNA 测序，所测菌株的序列通过Blast检索，并与GenBank中的核酸序列进行同源性比对，利用MEGA 软件，以邻接法绘制16S rDNA系统发育树(图3)，经16S rDNA 的同源性比较，菌株LQ1与脱氮海洋单胞菌(Oceanimonasdenitrificans)的相似性达99%。结合菌株LQ1的菌落形态、亚显微形态和生理生化特征，确定分离到的菌株LQ1为脱氮海洋单胞菌。

2.4 脱氮海洋单胞菌生长曲线的制作

在温度35 ℃、pH 9.0、碳氮比为22、氯化钠质量浓度15 g/L条件下，将脱氮海洋单胞菌LQ1培养24 h，绘制细菌生长曲线，结果见图4。由图4可见，1～3 h期间，细菌为迟缓期，4～21 h为对数生长期，21 h以后为稳定期和衰退期。

2.5 脱氮海洋单胞菌去除亚硝态氮效果

将脱氮海洋单胞菌LQ1接种到培养基中，定期检测亚硝态氮含量的变化，结果见图5。由图5可见，随着时间的延长，培养体系中亚硝态氮质量浓度逐渐减小，12 h时，亚硝态氮质量浓度达到0.73 mg/L，去除率达98.69%，可见脱氧海洋单胞菌LQ1具有很好的亚硝态氮去除效果。

图2 菌株LQ1的16S rDNA电泳图谱

图3 基于16S rDNA 序列同源性的菌株LQ1 的系统发育树

图4 脱氮海洋单胞菌LQ1生长曲线

图5 脱氮海洋单胞菌LQ1去除亚硝态氮效果

2.6 碳氮比、pH和温度对脱氮海洋单胞菌LQ1脱氮率的影响

2.6.1 碳氮比对脱氮率的影响

设置7个碳氮比梯度，研究其对菌株脱氮率的影响，结果见图6。由图6可见，试验6 h和12 h出现了类似的结果，均是碳氮比为7时，脱氮率最低，而后逐渐增加；当碳氮比达到16时，脱氮率达到最大，为99.22%，而后随着碳氮比的增加，脱氮率略微降低，但幅度很小，说明碳氮比为16时，脱氮海洋单胞菌LQ1的脱氮效果最好。

图6 碳氮比对脱氮海洋单胞菌LQ1脱氮率的影响

2.6.2 pH值对脱氮率的影响

将脱氮海洋单胞菌LQ1接入到不同初始pH值的培养基中，其脱氮率结果见图7。由图7可见，随着pH的增加，菌株的脱氮率逐渐增大，pH为9时，脱氮率最大，12 h脱氮率达98.73%，而后随着pH的增加，脱氮率逐渐减小。可见脱氮海洋单胞菌LQ1脱氮适宜的初始pH为9。

图7 pH对脱氮海洋单胞菌LQ1脱氮率的影响

2.6.3 温度对菌株脱氮率的影响

将脱氮海洋单胞菌LQ1接入培养基，置于不同温度下培养，分别于6 h和12 h测定亚硝态氮含量，并计算脱氮率，结果见图8。由图8 可见，随着温度的升高，菌株的脱氮率逐渐增大，当温度增至35 ℃时，菌株的脱氮率最大，达98.06%，而后随着温度的升高，菌株的脱氮率出现降低的趋势，但减幅缓慢，说明脱氮海洋单胞菌LQ1的脱氮适宜在较高温度下进行。

图8 温度对脱氮海洋单胞菌LQ1脱氮率的影响

3 讨 论

传统意义上的硝化作用指自养硝化。虽然自养硝化菌在水体氮循环中起到非常重要的作用[10]，但自养硝化细菌分离困难、生长速度慢、生物量小、代时长及对环境因子敏感等特点[11]在一定程度上阻碍了硝化细菌在水产养殖领域的推广应用。异养硝化细菌以其生长速度快、代时短及对环境因子迟钝等特点，引起了人们的极大关注。研究者分离鉴定出来了一些异养硝化细菌[12-16]，但自水产养殖水体中分离鉴定异养硝化细菌还较少见，研究异养硝化细菌的脱氮机理也不多。芮传芳等[17]从巢湖底泥中分离出一株具有氨氮转化活性的异养硝化细菌，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)；王李宝等[18]自江苏通州、海安和吕四地区的养殖池塘浅层底泥中分离得到4株具明显硝化活性的异养硝化细菌，通过形态学和生理生化研究，初步鉴定为芽孢杆菌。崔青曼等[19]从对虾底泥中分离纯化出一株高效去除亚硝态氮的细菌，鉴定为鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)；袁春营等[20]进行了鲁氏不动杆菌(A.lwoffii)的盐度驯化与亚硝态氮去除机理研究。郑宗林等[21]从福州市闽侯县高岐工业园区某工厂排污口淤泥及垃圾渗出液中分离出一株反硝化聚磷菌和一株高效聚磷菌，经生理生化特征分析并结合16S rRNA编码基因序列分析对两株菌进行鉴定，二者分别为类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)和琼氏不动杆菌(A.junii)。本次从对虾养殖后期水体中分离一株硝化细菌，具有良好的亚硝酸氮去除效果，并确定了它的最佳脱氮条件，下一步拟进行脱氮海洋单胞菌LQ1的脱氮机理研究，同时与其他微生物配伍，制备对虾专用微生态制剂，以期降低对虾养殖后期水体中的亚硝态氮含量，确保对虾健康生长。