去甲斑蝥素对人卵巢癌细胞株AO增殖及细胞周期的影响

熊礼凤 杨江升 楼银妹 汪霖 李平儿 李华美

斑蝥是祖国医学宝库中，被反复证明行之有效的抗肿瘤药物［1］，后人依据其抗肿瘤的有效成分人工合成了抗癌新药—去甲斑蝥素（NCTD），在保留斑蝥抗癌活性的同时，还具有升高白细胞及增强机体自身的免疫能力等诸多优点，临床上用于消化道恶性肿瘤的治疗方面已取得较好的临床疗效［2-5］。但其在卵巢癌应用基础研究和临床研究方面还相当薄弱［6］。作者自2015年11月至2018年1月通过实验研究，探讨NCTD对人卵巢癌细胞株AO增殖的抑制作用及细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验细胞株及培养：选择中国科学院上海细胞生物研究所培育的人卵巢癌细胞株AO（或3AO）。细胞在37.0℃，5%CO2条件下，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液培养，每间隔72h用0.25%胰蛋白酶消化，传代1次/2～3d。（2）主要试剂及仪器：去甲斑蝥素（NCTD，北京第四制药厂）；0.4%台盼蓝染液（Gibco）；RPMI-1640液体培养基及胰蛋白酶（GIBCO）；磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS，博士德）；胎牛血清（四季青）；流式细胞仪（Beckman-Coulter）。

1.2 方法 （1）人卵巢癌细胞株AO培养的制备：人卵巢癌细胞株AO培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，一般传代1次/2～3d，实验所用的细胞均处于对数生长期。（2）人卵巢癌细胞株AO的增殖检测：取对数生长期的人卵巢癌细胞株AO共约5×105个分别接种于96孔板，分别加入终浓度为1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml， 以 0μg/ml（生理盐水）为对照的NCTD分别作用24、48、72h，各设置3个复孔，以生理盐水作为对照。按时间点收集人卵巢癌细胞株AO悬液；用100μl培养基重悬细胞，吸取10μl细胞悬液加入10μl台盼蓝染液中，轻轻混匀，染色1min，吸取少量已染细胞计数。3min计数完毕。细胞抑制率=（对照组存活细胞总数-实验组存活细胞总数）/对照组存活细胞总数×100%。（3）流式细胞仪检测：取对数生长期的人卵巢癌细胞株AO，按密度约1×106/ml接种于96孔板培养液中，并予终浓度1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml， 以 0μg/ml（ 生 理盐水）为对照的NCTD处理48h。48h后予以离心收集全部细胞，PBS洗2遍，用70%的冰乙醇重悬细胞，-20℃固定过夜，用PBS洗涤1遍，弃上清液加300μl DNA染液（内含碘化丙啶100g/ml和RNA酶20U/ml）37℃避光染色30min，PBS再洗涤2遍，流式细胞仪上检测，上述实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的NCTD对人卵巢癌细胞株AO的增殖影响 随NCTD浓度及作用时间的递增，其对人卵巢癌细胞的抑制效率也逐步增加，且各浓度组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同浓度NCTD对人卵巢癌细胞株AO的增殖影响［%，（±s）］

表1 不同浓度NCTD对人卵巢癌细胞株AO的增殖影响［%，（±s）］

注：与0μg/ml比较，#P＜0.05；与1μg/ml比较，*P＜0.05；与5μg/ml比较，△P＜0.05；与10μg/ml比较，☆P＜0.05

浓度（μg/ml）9.01±1.51 18.01±1.65 31.12±2.74 1 20.45±3.25# 37.04±4.65# 54.42±6.41#5 40.82±4.54#* 57.22±6.74#* 75.08±5.49#*10 56.98±4.79#*△ 72.49±4.65#*△ 91.13±3.15#*△20 79.22±5.49#*△☆ 94.11±2.75#*△☆ 98.50±0.35#*△☆作用时间（h）24 48 72 0

2.2 不同浓度的NCTD对人卵巢癌细胞株AO细胞周期的影响 与对照组比较，人卵巢癌细胞株AO经不同浓度的NCTD作用48h后的G0/G1，G2/M与S期差异有统计学意义（P＜0.05）。G2/M期细胞百分数明显增加，S期及G0/G1期细胞百分数减少，差异有统计学意义（P＜0.05），且随着NCTD浓度的升高，G2/M期细胞百分数明显增加，S期及G0/G1期细胞百分数减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同浓度NCTD处理48h细胞周期分布情况［%，（±s）］

表2 不同浓度NCTD处理48h细胞周期分布情况［%，（±s）］

注：与0μg/ml比较，#P＜0.05；与1μg/ml比较，*P＜0.05；与5μg/ml比较，△P＜0.05；与10μg/ml比较，☆P＜0.05

57.12±2.40 17.29±1.62 25.51±1.32 1 59.24±1.55# 15.36±0.75# 23.44±2.07#5 62.33±2.61#* 12.16±1.42#* 20.52±0.96#*10 65.20±3.05#*△ 9.61±0.63#*△ 18.46±2.12#*△20 72.14±2.12#*△☆ 7.45±0.36#*△☆ 12.65±1.26#*△☆浓度（μg/ml） G2/M S G0/G1 0

3 讨论

卵巢癌是发生在女性生殖系统恶性肿瘤的三大肿瘤之一，具有起病隐匿、早期临床症状不典型、易发生转移、预后差等特点［7］。因此虽然卵巢癌的发病率低于宫颈癌和子宫内膜癌，位居第3位，但其病死率却居女性生殖系统恶性肿瘤的首位［8］，＞70%的卵巢癌患者就诊时已有盆腔或淋巴结转移，已为中晚期，失去根治性手术的机会，5年生存率均不＞30%［9-10］，严重威胁患者的生命和健康。尽管目前临床上化疗是卵巢癌治疗主要手段，但患者对化疗药物的耐药性、不敏感性及部分患者对化疗的不耐受性，是肿瘤科医师面对的临床问题。因此，为卵巢癌患者寻找高效、低毒的抗癌药物是研究的重点和热点。

本资料显示，NCTD抑制人卵巢癌细胞增殖，在一定浓度下具有剂量及时间依赖性，NCTD在20μg/ml可短时间内在体外大量杀灭人卵巢癌细胞株AO。其抗癌机制是抑制恶性肿瘤细胞的蛋白质合成，降低肿瘤细胞CAMP的相关活性。进一步研究NCTD对人卵巢瘤细胞周期的影响。结果发现NCTD能使人卵巢瘤细胞发生周期阻滞，肿瘤细胞大多阻滞在G2/M期。提示NCTD诱导的人卵巢癌细胞株AO生长周期阻滞于DNA合成前期，并导致细胞分裂期细胞数量减少，细胞增殖受抑，从而达到NTCD抑制肿瘤细胞增殖的作用。

结果表明NCTD有望成为一种新型、有效、低毒的抗卵巢癌药物，也可与各种化疗方案联用，不仅可增强杀瘤效应，还同时具有升高白细胞，增强自身免疫力等作用。