复合菌肥对岷山红三叶生产性能和营养品质的影响

武慧娟，张 榕，李智燕，姚 拓，张 洁，谭立伟，周栋昌

(1.甘肃省草原技术推广总站，甘肃 兰州 730010； 2.甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室，甘肃 兰州 730070)

长期以来，传统的农业生产模式下，增加工业化肥的施用量一直被认为是实现农作物高产的主要途径[1]。然而，长期过量使用化肥带来的负面效应也日益凸显，土壤结构破坏、肥力下降，生物多样性下降，空气和水体污染，非再生能源大量消耗，农业成本上升，危害农牧业等食品安全和人类健康的诸多问题成为困扰农业生产的主要因素[2-3]。近年来，随着人们生态保护意识的增强以及对无公害农作物生产的日益重视，积极探索和研发新的低能耗、低排放和环境友好型肥料替代部分化肥，实现高效、循环农业已显得尤为重要[4]。

复合菌肥作为一种新型的肥料，是将一类活体微生物经大量人工培养制成的生物肥料，又称菌剂、生物接种剂、微生物肥料[5]。国内外研究表明，固氮菌肥和溶磷菌肥是比较理想的微生物肥料。固氮菌肥是利用能够从空气中固定氮素的固氮菌研制而成[6]，溶磷菌肥是由能够溶解、转化土壤中难溶性磷的溶磷微生物研制而成，而有些溶磷菌和固氮菌兼具分泌植物生长调节物质、促进植株根系生长、抑制病原菌生长、增强植株抗病能力等特性[7]，因此溶磷菌肥和固氮菌肥成为“环境友好型”肥料代替部分化肥作用于植物，具有减少工业化肥带来的生态污染、促进植物生长和提高品质、增强植物抗病性等优点[8]。

岷山红三叶(Trifoliumpratense‘Minshan’)是甘肃省地方特色牧草之一，属高产型优质豆科牧草，营养全面，再生性强，并且含有大量的异黄酮多酚化合物，其产业化在甘肃省优质高效草牧业发展中发挥着重要作用[9-10]。本研究利用豆科牧草的固氮特性，开展了岷山红三叶微生物复合专用菌肥的研发试验，研究了微生物复合专用菌肥与不同比例的化肥组合对岷山红三叶植株的生产性能及营养品质的影响，为进一步应用、推广该复合菌肥，实现作物增产和降低化肥使用提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于兰州市皋兰山全国草品种区域试验国家试验点，海拔1 685 m，地处 36°01′1.10″ N，103°49′47.71″ E，地形为台地，无坡向、坡度，土壤类型为灰钙土类，土壤pH 7.8～7.9。年平均降水量295.5 mm，年平均温度9.3 ℃，极端最高温度39.8 ℃，极端最低温度-18 ℃，无霜期193 d，≥0 ℃年积温3 816.3 ℃·d。

1.2 供试材料与设计

1.2.1供试材料 供试植物材料为岷山红三叶种子，经测定发芽率为70%，由岷县草原工作站提供。微生物复合专用菌肥是由甘肃省草原技术推广总站联合甘肃农业大学草地微生物实验室共同研发而成。化肥为尿素和磷酸二铵。

1.2.2岷山红三叶微生物复合菌肥制作 采集岷县当地生长旺盛的岷山红三叶植株及周围根系土壤，经前期处理后分别分离纯化得到根瘤菌、溶磷菌和生防菌菌株，将溶磷菌和生防菌株分别接种于LB培养基中进行扩繁，将根瘤菌菌株于YMA平板培养基上纯化培养，再于YMA液体培养基中扩繁，扩繁得到各菌株菌悬液备用。将木炭基质与市售有机肥以2∶1比例混合作为复合菌肥载体，对其进行γ射线辐照灭菌，灭菌后倒入无菌自封袋，用无菌吸管吸取菌悬液5 mL接种到自封袋载体中，立即封口。待菌液与载体混合均匀后，用灭菌针在自封袋中央扎几个小孔，之后在自封袋外面再套一层自封袋，并在外层自封袋的四周扎几个小孔，以上操作均在无菌条件下进行[11-12]。将做好的岷山红三叶复合菌肥置于28～30 ℃下培养7 d，之后常温保存，期间防止污染。

1.2.3田间试验设计 试验处理具体见表1，以全量化肥作为对照(CK)，不同比例的化肥与微生物复合菌肥用A、B、C、D 表示(表1)，共5个处理，每个处理重复3次。每个小区种植面积为3 m×4 m。播种量为18 kg·hm-2，条播，行距30 cm，播种深度2 cm，播种气温27 ℃。定期进行人工除草、灌溉等田间管护，不使用除草剂。

播种前种子预处理：播种前，A、B、C、D处理中将岷山红三叶种子用微生物复合菌肥拌种后置于阴凉、避光处，2 h(使微生物复合菌肥充分附着在种子表面)后方可播种，对照种子不做任何处理。微生物复合菌肥用量为125 g固体菌肥拌1 kg种子，对照种子用无菌水拌种。施肥量为：对照(100%化肥)用量为尿素255 kg·hm-2、磷酸二铵255 kg·hm-2，其余各处理分别按比例减少化肥用量，微生物复合菌肥的量除对照外，其余各处理添加量一致(微生物复合菌肥与种子拌种，效用一般与量的多少无关)(表1)。

表1 试验设计Table 1 Experimental design

1.3 测定指标及方法

株高：不同生育时期，每个小区随机测定10株植株高度,取平均值；产量：岷山红三叶达到初花期时，每个小区测定2 m2鲜草产量，将鲜样带回实验室，用烘箱烘干测定干重；干鲜比：从每个小区内各取1 kg鲜样，将其剪成3～4 cm长的草段，编号称重，置于105 ℃烘箱内杀青10 min后，65 ℃烘48 h至恒重，称重，计算干鲜比；营养品质分析：粗蛋白(CP)采用凯氏定氮法测定，粗脂肪(EE)采用索氏脂肪抽提法，粗灰分(Ash)采用灰化法测定，酸性、中性洗涤纤维(ADF、NDF)采用范式(Van soest)纤维分析法测定，钙(Ca)采用EDTA-Na2络合滴定法测定，磷(P)采用氢醌亚硫酸钠比色法测定[13]。

相对饲喂价值(RFV)[14]=DDM×DMI/1.29。

式中：可消化干物质(DDM)=88.9-0.779ADF，干物质采食量(DMI)=120/NDF。

1.4 数据处理

所得数据采用Excel和SPSS 17.0进行数据分析，使用多重比较(Duncan)进行处理，采用字母标记法来表示各处理间的差异性。

2 结果与分析

2.1 不同肥料组合对岷山红三叶不同物候期株高的影响

种植当年，苗期植株在CK、B、C和D处理时，株高均显著高于A处理(P<0.05)；C与D处理间无显著差异(P>0.05)，但均显著高于CK处理(P<0.05)；D处理(75%化肥+复合菌肥)植株最高，达到21.47 cm。现蕾期，植株在D处理时，显著高于CK、A和B处理(P<0.05)，C、D处理间差异不显著(P>0.05)，A处理下株高最低；初花期各处理之间株高差异均不显著(P>0.05)，但D处理比A处理高9.06%。

第2年，岷山红三叶在返青期植株表现为，CK与D处理下株高一致，二者均高于其他3个处理，且显著高于A处理(P<0.05)。第1茬现蕾期各处理之间差异不显著(P>0.05)；第1茬初花期刈割时，D处理显著高于A处理(P<0.05)，其余各处理间差异均不显著(P>0.05)。第2茬现蕾期D处理只与A处理之间差异显著(P<0.05)；第2茬初花期各处理间结果与现蕾期相似，C处理株高比CK和A处理高3.18和7.73 cm，D处理比二者高4.17和8.72 cm(表2)。

2.2 不同肥料组合对岷山红三叶产量的影响

种植当年岷山红三叶鲜草产量，A处理显著低于C和D处理(P<0.05)，其他各处理间差异不显著(P>0.05)。第2年，第1茬鲜草产量D处理最高，显著高于其他处理(P<0.05)；第2茬鲜草产量C处理比D处理高1 532 kg·hm-2，但二者间差异不显著(P>0.05)；全年累计鲜草产量各处理之间表现为D>C>B>CK>A(表3)。

种植当年干草产量C处理最高，为8 563 kg·hm-2；显著高于A、B处理(P<0.05)，但与CK和D处理间差异不显著(P>0.05)，A处理(6 182 kg·hm-2)产量最低。第2年第1茬干草产量，D处理(8 220 kg·hm-2)最高，C处理(7 410 kg·hm-2)次之，二者之间差异显著(P<0.05)；第2茬干草产量则以C处理(7 037 kg·hm-2)最高，D处理(6 846 kg·hm-2)次之，但二者之间差异不显著(P>0.05)；从全年累计干草产量而言，D处理产草量最高，C处理次之，二者之间差异不显著(P>0.05)，但二者均与CK和A处理差异显著(P<0.05)。A处理下无论是鲜草还是干草产量均为最低，这说明微生物复合菌肥单一施用对岷山红三叶的增产效果较差(表3)。

2.3 不同肥料组合对岷山红三叶营养品质的影响

比较3次测定结果(表4)，岷山红三叶中酸性洗涤纤维含量除种植当年处理A与CK间差异不显著(P>0.05)外，其他各处理均与CK差异显著(P<0.05)；A、B、C、D 处理的岷山红三叶中性洗涤纤维含量均显著低于CK(P<0.05)，且4个处理在第1年和第2年第1茬均表现为差异不显著(P>0.05)。

岷山红三叶的相对饲喂价值在各处理间差异明显，种植当年，D处理显著高于CK与A处理(P<0.05)，但与B和C处理之间差异不显著(P>0.05)；第2年，第1茬A、B、C、D 之间差异不显著，但均显著高于CK(P<0.05)，其中D处理最高，为173.05%，比CK提高了35.32%。

种植当年，岷山红三叶中粗灰分含量在各处理中表现为D处理显著高于CK(P<0.05)，其余各处理间差异不显著(P>0.05)；第2年第1茬，A、B、C、D 处理均显著高于CK(P<0.05)，且C、D分别与A、B之间差异显著；第2茬中C、D处理显著高于CK和A处理(P<0.05)，其余处理间差异不显著。

岷山红三叶钙含量因所施化肥比例不同而有所不同。种植当年，A、B、C、D 处理中岷山红三叶Ca含量均高于CK，且A、B处理与CK差异显著(P<0.05)，C、D处理与CK差异不显著(P>0.05)；第2年第1茬，除A处理外，其余各处理均高于CK，但差异不显著(P>0.05)；第2茬中A、B、C 3个处理Ca含量低于CK，D处理时Ca含量最高，为1.74%。

受菌肥影响，岷山红三叶中磷含量变化明显。种植当年，C、D处理P含量显著高于CK(P<0.05)，但二者间差异不显著(P>0.05)；第2年第1茬，A、C、D处理P含量显著高于CK(P<0.05)，B处理与CK差异不显著(P>0.05)；第2茬中，A、B、C、D 处理均显著高于CK(P<0.05)，且D>C>B>A>CK，分别高于CK 13.92%、16.82%、19.80%、25.51%。

微生物复合菌肥与化肥按不同比例配施对岷山红三叶茎叶比影响不大，各处理之间差异均不显著(P>0.05)(图1)。

菌肥与化肥不同组合处理对岷山红三叶中粗蛋白含量影响较大。种植当年，各处理中粗蛋白含量高低排序为D>C>B>A>CK，其中B、C、D 处理与CK差异显著(P<0.05)，但三者相互间差异不显著(P>0.05)。第2年，第1茬中A、B、C、D处理时的CP含量均显著高于CK(P<0.05)，D处理CP含量最高，显著高于A处理(P<0.05)，A、B、C处理相互间差异不显著(P>0.05)；第2茬中A、B、C、D处理的CP含量均显著高于CK(P<0.05)，但A、B、C、D相互间差异不显著(P>0.05)(图2)。

不同肥料组合处理后岷山红三叶中粗脂肪含量差异显著(P<0.05)。第1年，A、C处理与CK间差异显著(P<0.05)，第2年第1茬各处理间差异不显著(P>0.05)，但均略高于CK；第2茬C、D处理与CK间差异显著(P<0.05)，从测定结果来看，第2年两茬岷山红三叶EE含量均低于第1年，相同处理下，第1年岷山红三叶中EE含量分别是第2年第1茬的1.94、1.66、1.70、1.50、1.46倍(图3)。

3 讨论与结论

近年来，国家大力提倡生态保护、循环农业和食品安全，微生物肥料作为21世纪的新型肥料，备受人们关注。本研究结果显示，将岷山红三叶根际分离出的溶磷菌与根部分离的根瘤菌及生防菌共同研制成复合菌肥与化肥按不同比例配施，其中75%化肥+复合菌肥效果最佳，可以使岷山红三叶株高、干草产量分别比对照提高1.82 cm、608 kg·hm-2(第1年)、4.87 cm、1 404 kg·hm-2(第2年第1茬)、4.17 cm、691 kg·hm-2(第2年第2茬)，50%化肥+复合菌肥作用效果次之，其中干草产量与对照显著差异(P<0.05)，这可能是因为复合菌肥中含有的根瘤菌具有自身固氮能力，可以增加土壤中氮元素的含量，溶磷菌可以转化土壤中难溶性磷素，从而改善牧草生长时土壤环境中营养元素的供应状况；同时，它们在生长、繁殖过程中产生的植物激素(吲哚乙酸、脱落酸、细胞分裂素、赤霉素等)可以刺激和调节作物的生长发育，达到增产效果[15-17]，此结果也与苜蓿(Medicagosativa)[18]和燕麦(Avenasativa)[19]中接种促生菌对其株高和产量有显著促进作用的研究结果一致。本研究同时还发现，25%化肥+复合菌肥对岷山红三叶并无显著的增产效果，菌肥单施后其产草量甚至不及化肥单一施用，这说明在目前农业生产水平下，生物菌肥单一施用对植物的促生效果均不及化肥单一施用或二者合理配施，其还不能完全替代化肥应用于农业生产中。

表4 不同肥料组合对岷山红三叶营养品质的影响Table 4 Effect of different fertilizer combinations on nutritional quality of Trifolium pratense ‘Minshan’

处理Treatment酸性洗涤纤维Acid detergent fibre(ADF)/% 中性洗涤纤维Neutral detergent fibre(NDF)/%相对饲喂价值Relative feed value(RFV)/%粗灰分Crude ash(Ash)/%钙Ca/%磷P/%第1年First yearCK36.02±0.54a44.95±1.43a126.17±4.26c12.24±0.20b1.39±0.02b0.212 6±0.013 0bA32.14±1.10ab39.25±0.60b151.41±1.77b12.13±0.10b1.68±0.10a0.219 6±0.002 5abB29.89±0.46b37.77±1.30b161.97±5.62ab12.54±0.29ab1.69±0.09a0.221 0±0.005 7abC30.36±2.14b37.49±0.16b161.96±4.84ab12.75±0.56ab1.61±0.07ab0.236 4±0.005 2aD28.42±1.92b36.95±0.72b168.23±5.71a13.56±0.23a1.63±0.06ab0.237 9±0.002 7a第2年第1茬Second yearfirst cropCK35.34±1.41a44.83±1.82a127.88±6.89b8.87±0.24c1.73±0.09a0.243 4±0.018 4bA29.12±0.47b37.42±0.69b164.74±3.96a10.08±0.27b1.72±0.09a0.287 4±0.011 3aB27.94±0.35b38.20±0.42b163.51±2.29a10.17±0.12b2.00±0.16a0.275 9±0.015 6abC27.59±0.73b37.13±0.38b168.90±2.22a11.02±0.29a1.85±0.13a0.288 3±0.005 1aD27.60±0.78b36.23±0.12b173.05±2.14a11.40±0.32a1.89±0.11a0.306 1±0.007 5a第2年第2茬Second yearsecond cropCK42.63±1.22a51.35±0.66a100.94±2.60d9.11±0.13b1.72±0.04ab0.288 9±0.017 3bA34.08±0.17b46.22±1.18b125.66±3.11c9.13±0.23b1.56±0.14b0.329 1±0.010 9aB31.82±0.85bc42.00±0.92d142.10±2.54a9.84±0.25ab1.67±0.16a0.337 5±0.006 2aC30.46±0.77c43.52±0.41cd139.34±2.50ab10.47±0.33a1.70±0.03ab0.346 1±0.008 3aD32.11±1.25bc44.52±0.18bc133.47±1.81bc10.55±0.18a1.74±0.08ab0.362 6±0.015 2a

图1 不同肥料组合对岷山红三叶茎叶比的影响Fig. 1 Effect of different fertilizer combinations on stem/leaf of Trifolium pratense ‘Minshan’

图2 不同肥料组合对岷山红三叶粗蛋白含量的影响Fig.2 Effect of different fertilizer combinations on crude protein content of Trifolium pratense ‘Minshan’

图3 不同肥料组合对岷山红三叶粗脂肪含量的影响Fig. 3 Effect of different fertilizer combinations on ether extract content of Trifolium pratense ‘Minshan’

李玉娥等[7]将溶磷菌接种到苜蓿，不仅能提高苜蓿对土壤磷素利用效率，提高结瘤、固氮作用，还能明显增加苜蓿株高、茎粗、干鲜比、干重、茎叶比；韩华雯等[12]将溶磷菌和根瘤菌研制成的苜蓿根际专用接种剂与半量磷肥共同作用于苜蓿，叶茎比提高13.79%(第1茬)和16.87%(第2茬)。本研究中却发现，菌肥与化肥不同比例配施对岷山红三叶茎叶比影响不大，且复合菌肥单一施用效果均不及对照，这可能是由于试验区气候条件、宿主植物、促生菌类型及土壤状况等多种因素不同，综合导致菌肥在田间的效果不同[10,20]。

饲草料作物营养品质的优劣不仅直接影响家畜的生长发育，还影响畜产品的产量和质量，饲草料营养品质的好坏则很大程度上取决于粗蛋白和粗纤维含量，提高饲草料蛋白、降低纤维含量是提高其营养价值、改善牧草品质的重要内容[21-22]。有研究表明，微生物复合菌肥可以有效促进作物生长使其增产，而且在改善作物营养品质方面也具有较大潜力[10,12]。本研究中微生物复合菌肥与化肥不同比例配施后发现，菌肥单施或与不同比例化肥配施均能使岷山红三叶中CP含量显著提高，ADF和NDF含量显著降低(P<0.05)；其中：75%化肥+复合菌肥作用最突出，CP含量较CK平均提高2.8%，ADF和NDF含量较CK分别平均降低8.62%、7.81%，这与在岷山红三叶[10]和燕麦[2]中的研究结果一致。这可能与复合菌肥中含有的有益微生物的溶磷作用以及分泌氨基酸、生长素、维生素和其他活性小分子衍生物有关，还可能是不同微生物协同作用的结果[23]。另外，本研究结果显示：75%化肥+复合菌肥还能使岷山红三叶中CP、EE、Ca、P含量分别较对照平均提高了18.36%、59.90%、9.23%和21.06%，出现这样的结果可能是复合菌肥中含有的有益微生物的代谢作用加强了土壤中有机物的分解，促进了植物营养元素的矿化，对土壤养分库进行了活化，增加了作物的营养供应并促进植物对营养元素的吸收，比如解磷微生物分泌出的有机酸能够降低降低土壤pH，又可与铁、铝、钙、磷等离子结合，从而使难溶性的磷酸盐溶解。另外，还可以提高了土壤微生物种群密度，微生物在生命活动的过程中不断地释放土壤中的缓效状态的氮、磷、钾，改善土壤的微生物环境，提高了土壤速效氮、磷、钾的含量[24-26]。

综上所述，75%化肥+复合菌肥配施不仅有益于岷山红三叶生长、提高其产草量，还可以改善品质，还能促进相对饲喂价值、粗蛋白、粗脂肪、钙、磷含量的提高和降低酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维含量，有效改善其适口性和消化率；50%化肥+复合菌肥对岷山红三叶的生产性能和营养品质影响效果虽不及70%化肥+复合菌肥，但可以大大减少对化肥用量，减轻对生态环境的污染，对于实现农牧业可持续发展具有十分重要的意义。然而，微生物的种类、特性、功能不尽相同，并且菌株促生功能的发挥、在植物根际的有效定植等受到气候条件、土壤类型、土著微生物、植物类别等多种因素的影响[12,27]。因此，挖掘更多的有益菌类，制备更好的环保生物菌肥，并逐步替代化肥应用于生产，最终实现真正的绿色农业，仍需要进一步深入研究。