液相色谱-串联质谱法快速测定蛇足石杉中的石杉碱甲

李东芹，孙 玲

(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，湖北武汉 430070)

蛇足石杉，又名千层塔，为石杉科多年生蕨类植物，民间多用来治疗跌打损伤、毒蛇咬伤和烧烫伤等。20世纪80年代，中国医药研究工作者从蛇足石杉中分离出强生物活性的石杉碱甲，并引发其药用价值的研究高潮[1]。石杉碱甲是一种高效乙酰胆碱酯酶抑制剂，具有开发记忆效率的功能。临床用于治疗老年痴呆症具有确切的疗效[2-3]，还有文献报道可用于重症肌无力的治疗[4-5]。由于人工合成很难得到纯化学活性的石杉碱甲，因此从石杉科植物中提取还是其主要来源。目前为止，石杉中石杉碱甲基本都是用高效液相色谱法[6-8]来测定，液质联用法鲜见报道，有少量血桨中石杉碱甲液质分析的报道[9-10]。液相色谱法耗时长、试剂用量大、灵敏度低、易受其他物质干扰，对前处理工作要求较高，分析误差大。受前人研究的启发[11-12]，笔者建立了蛇足石杉中石杉碱甲的液相色谱-串联质谱方法，样品经液相色谱分离后进入质谱仪，用石杉碱甲的特征离子对243.2 > 210.1来进行定量测定，为批量定量分析石杉碱甲提供了更好的选择。

1 材料与方法

1.1仪器API 4000 Qtrap 串联三重四级杆线性离子阱质谱仪(美国AB Sciex公司)；LC-20AD高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)；氮吹仪(OA-SYS，N-EVPTM111型)；Milli-pore 超纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2试材甲醇(色谱纯)；超纯水；石杉碱甲(含量≥98%，Mw=242.3)；乙酸(色谱纯)；1 mL医用注射器；0.22 μm微孔滤头(上海安普)。蛇足石杉采自安徽，为华中农业大学植科院姚明镜老师提供。

1.3试验方法

1.3.1样品制备。精确称量0.4 g左右的样品，加氨水润湿后用适量体积氯仿萃取3～4次，每次约8 h。汇总萃取液，用氮吹仪吹干，用甲醇溶解后定容到25 mL。再用1 mL医用注射器与0.22 μm过滤头过滤后移入自动进样器样品瓶。

1.3.2标准溶液制备。精密称取石杉碱甲粉末1.4 mg，甲醇溶解后定容至50 mL，作为标准储备液。取适量的储备液，用纯甲醇逐步稀释成浓度为70.000、35.000、17.500、8.750、4.375 μg/L 系列梯度的标准溶液，依次移入液相色谱自动进样器样品瓶。

1.3.3定量检测条件。

1.3.3.1色谱条件。岛津Shim-pack VP-ODS(150 L×2.0 mm，5 μm)色谱柱，样品室温度为室温；流动相：A为0.1%的乙酸水溶液，B为甲醇；流速为0.3 mL/min。梯度洗脱条件：A∶B，0 min 为 0∶100(V/V)，10 min为 20∶80(V/V)，10.01 min 为0∶100(V/V)，15 min为0∶100(V/V)，柱温箱温度为40 ℃，进样量为10 μL。

1.3.3.2质谱条件。采用电喷雾(ESI)离子源，在正离子电离模式下选用多反应离子监测(MRM)扫描模式进行测定。电喷雾电压5 500 V；离子源温度500 ℃；离子源辅助气GS1/GS2气流均为50 L/h。

2 结果与分析

2.1质谱解析将浓度为100 μg/L的石杉碱甲标准品通过针泵注射器直接进入质谱分析，先利用Q1全扫描确定石杉碱甲的母离子为243.2(M+1)；再在一定能量下进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到石杉碱甲的碎片离子信息(图1a)；选择丰度较大的子离子210.1与母离子243.2组成多反应监测(MRM)离子对进行定量分析。为了确保离子对243.3 >210.1 灵敏度高与信号稳定，分别对解簇电压(DP)、入口电压(EP)、碰撞能量(CE)和碰撞出口电压(CXP)等质谱参数进行优化，优化后各参数分别为DP为70 V、EP为10 V、CE为40 V、CXP为13 V。

图1b为石杉碱甲在“1.3.3.2”质谱条件下的选择离子流图，其色谱保留时间在1.46 min。

图1 石杉碱甲的二级质谱图(a)和总离子流图(b)Fig.1 Secondary mass spectrum(a)and total ion current map(b)of Huperzine A

2.2标准曲线方程和检出限将“1.3.2”项配制好的石杉碱甲系列标准溶液按由稀到浓的顺序依次放入自动进样器样品架，在“1.3.3”项试验条件下进行联机分析。以标准溶液浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，得到线性方程为y=11 100x+2 490(r=0.998 9)，表明在浓度为4.375～70.000 μg/L线性良好。

将标准溶液逐步稀释至11.750、0.875、0.438、0.146 μg/L，在“1.3.3”项试验条件下逐一分析，最终确定该方法的定量检出限为0.438 μg/L，信噪比S/N为10。

2.3精密度试验将精确浓度为17.5 μg/L的标准溶液，重复进样5次，测定结果分别为18.2、18.1、17.9、17.7、18.4 μg/L。经计算得5次测定结果的变异系数为1.5%，精密度良好。

2.4回收率试验精确称量已知石杉碱甲含量的蛇足石杉样品，分别加入10、30、50 μg/L浓度水平的石杉碱甲标准溶液，按“1.3.2”方法进行样品制备，每个浓度进行3个样本分析，与标准曲线同时测定，考察样品回收率。结果发现(表1)，在这3个浓度下，石杉碱的回收率为96.0%～102.3%，相对标准偏差(RSD)为2.18%。

表1 石杉碱甲的回收率及RSD

2.5方法应用分别称取蛇足石杉的全株、叶、茎、根，按“1.3.1”项方法进行前处理，在“1.3.3”项试验条件下测定，通过线性方程分别计算得到其石杉碱甲的含量分别为5.331 4、1.798 2、0.570 3、0.292 0 μg/g。

3 小结与讨论

与以往常用的液相色谱检测方法相比，该研究建立的液相色谱-质谱联用法具有分析速度快、灵敏高、选择性好等特点。它将色谱的高分离能力和质谱的高灵敏检测能力相结合，实现优势互补，因而大大提高了检测的灵敏度和选择性。样品前处理操作简单，试剂用量少，既经济又环保。该方法可为开发和利用蛇足石杉这一药用植物资源提供有力的技术支持和帮助。