肾茶总黄酮的含量测定

陆应彩 卯明霞 彭霞 姜明辉 王志杰

【摘 要】 目的： 制定肾茶中总黄酮的含量测定方法。方法：采用紫外分光光度法进行了线性关系、准确度、精密度、不同产地、不同部位以及试验条件的考察来建立肾茶中总黄酮的含量测定的方法，测定了9个不同产地22批肾茶中总黄酮的含量。结果：22批样品总黄酮的含量分别为16.07%、17.58%、15.42%、14.04%、17.43%、15.75%、11.93%、19.71%、17.65%、16.20%、17.98%、24.39%、12.28%、15.70%、18.31%、17.19%、16.79%、10.38%、26.21%、30.66%、23.44%、14.00%； 5批不同部位总黄酮的含量按茎分别为：11.11%、11.74%、9.51%、12.59%、13.41%；按叶分别为26.57%、25.84%、20.07%、32.67%、35.07%，结果显示不同产地及不同部位样品中总黄酮的含量有差异。重复性实验的相对标准偏差为0.060%，回收率为95.13%～100.01%，标准品芦丁在2～48μg的范围内线性关系良好，r2 = 0.9998，符合要求。 结论：该方法简便、快速、准确，可作为检验肾茶中总黄酮的含量的一种手段，适用于肾茶的日常分析和质量控制。

【关键词】 紫外分光光度法；肾茶；总黄酮；含量测定

【中图分类号】R917 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）11-0037-05

Abstract：Objective To establish the method for content determination of total flavonoids in clerodendranthus spicatus. Method Method for the determination of the content of UV spectrophotometry was used for linearity， repeatability， precision and recovery rate， different areas， different parts and test conditions to establish the total flavonoids in Clerodendranthus， The content of total flavonoids from 9 different areas in 22 batches in Clerodendranthus.Results The content of total flavonoids in 22 batches of samples was 16.07%， 17.58%， 15.42%， 14.04%， 17.43%， 15.75%， 11.93%， 19.71%， 17.65%， 16.20%， 17.98%， 24.39%， 12.28%， 15.70% ， 18.31%， 17.19%， 16.79%， 10.38%， 26.21%， 30.66%， 23.44%， 14.00%； The contents of total flavonoids in 5 batches were： 11.11%， 11.74%， 9.51%， 12.59% and 13.41%， respectively. The leaves were 26.57%， 25.84%， 20.07%， 32.67% and 35.07%， respectively.showed that there are differences in content of total flavonoids in samples from different habitats and different parts of the. The relative standard deviation of repeatability experiment is 0.060%， and the recovery rate is 95.13% ～ 100.01%. The rutin standard is linear in the range of 2～48 μg， r2= 0.9998， which meets the requirements. Conclusion The method is simple， rapid and accurate， can be used as a means to test the content of total flavonoids in Clerodendranthus， suitable for routine analysis and quality control of c.spicatus.

Keywords：UV Spectrophotometry； Clerodendranthus Spicatus；Total Flavonoids； Content Determination

腎茶Clerodendranthus spicatus（Thunb.）C.Y.Wu又名猫须草，傣名“雅糯秒”，全草入药，为傣医常用药，有清火解毒，利尿排石，凉血止血之功[1]。傣药是四大民族医药之一，肾茶是傣医临床常用、疗效确切、具有解毒特色的常用品种，已开发出一些傣药产品如肾茶袋泡剂，取得了良好的经济效益和社会效益。肾茶含有橙黄酮、3′- 羟基-5，6，7，4′-四甲氧基黄酮、α-香树素、、熊果酸、6-甲氧基芫花素、5-羟基- 7 ，3′，4′-三甲氧基黄酮、鼠尾草素、5- 羟基-6 ，7，3 ，4′-四甲氧基黄酮、泽兰黄素、3′- 羟基- 5 ，7，8，4′- 四甲氧基黄酮、异橙黄酮、黄芪苷、异槲皮素、原儿茶醛、原儿茶酸、3，4 -二羟基苯酰甲醇 、迷迭香酸、迷迭香酸乙酯、秦皮乙素等化合物[2-5]，其中含有的甲氧基黄酮主要是橙黄酮、半齿泽兰素、半齿泽兰素-5-甲醚（结构式见图）。文献报道[6-15]甲氧基黄酮类具有明显的抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节及保护心血管作用，被誉为“天然抗氧化剂”。肾茶的标准收载于《湖南省中药材标准》（2009年版）、《广西壮族自治区壮药质量标准》（第二卷）（DYB45-GXZYCO111-2011），《云南省中药饮片标准》2005年版第一册。目前，未见对肾茶饮片总黄酮含量测定的报道[16]，按《中国药典》2015年版四部通则[17]建立肾茶总黄酮含量测定方法，为肾茶质量标准的提高及后期产品研发奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UV-2550紫外可见光分光光度仪（岛津）；101-EBS电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器厂）； DZKW-D-6 DIAN水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）； BL310天平（德国赛多利斯集团）；AE200电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。

1.2 材料 芦丁对照品（批号：100080-201610，中国食品药品检定研究院）。无水乙醇（分析纯）、氢氧化钠（优级纯）、亚硝酸钠（分析纯）、硝酸铝（分析纯）均为天津市风船化学试剂科技有限公司生产，水为蒸馏水。不同产地的22批药材分别采自云南景洪市、云南勐海县、云南勐腊县、云南普洱市、海南、云南瑞丽、云南元江、福建厦门、广西南宁。由西双版纳州食品药品检验所彭霞主任药师鉴定为唇形科植物肾茶 Clerodendranthus spicatus （Thunberg） C. Y. Wu ex H. W. Li 的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品25 mg，置50 mL量瓶中，加乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取20 mL，置50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得（每1 mL中含芦丁0.2 mg ）。

2.2 标准曲线的制备 精密量取对照品溶l、2、3、4、5、6 mL，分别置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法（通则0401），在500 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.3 测定法 取本品粉末約0.12 g，置具塞三角瓶中，精密称定，加入50%乙醇溶液100 mL，精密称定，置85℃水浴上回流1 h，放冷，精密称定，用50%乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，置25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6 mL”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量。按干燥品计算，含总黄酮以芦丁（C27H30O16） 计的量。

2.4 吸收光谱的测定、光谱一致性检测 精密吸取芦丁对照品溶液、供试品溶液各4 mL，分别置25 mL量瓶中，照分光光度法，在200～750 nm波长范围内测定吸收光谱，结果芦丁对照品与供试品光谱吸收图谱基本一致，在500 nm波长处有最大吸收。参照肾茶胶囊中总黄酮的含量测定[18]及《中国药典》（2015年版一部）[19]收载 “山楂叶”中总黄酮的含量测定方法中芦丁的测定波长为500 nm，因此选取检测波长为500 nm。

2.5 线性关系考察 精密吸取芦丁对照品溶液0.25、0.50、0.75、1、2、3、4、5、6 mL（相当于芦丁1.98090、3.96180、5.94270、7.92360、15.84719、23.77079、31.69439、39.61798、47.54158 μg/mL），按上述测定法测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标 ，绘制标准曲线，计算得回归方程：Y= 0.01229X-0.00251，r2=0.9998，试验结果表明芦丁在2～48μg/mL范围内的线性关系良好。

2.6 精密度试验 取同一批号样品6份（产地：西双版纳勐腊县勐满农场，批号：1612312），按供试品测定方法测定，总黄酮平均含量为17.3%，RSD为0.78%。

2.7 重复性试验 精密量取2.1项下对照品溶液（31.69439μg/mL），按“2.3”项下方法操作，依次测定7次，以吸收度值计算RSD为0.060%，结果符合要求。

2.8 加样回收率试验 根据《中国药典》2015版四部（通则9101），药品质量标准分析方法验证指导原则中准确度相关规定，设计同一浓度，9份供试品溶液照2.3方法进行测定，用9个测定结果进行评价。该分析方法的回收率为95.13%～100.01%，且RSD为1.58%，结果符合要求。表明该法准确可靠，可用于肾茶总黄酮含量测定。

2.9 样品测定 取不同产地22批肾茶，按照上述方法制备供试品溶液，分别测定22批样品，按2.2确定的工作曲线，以干燥品计算总黄酮含量，结果见表1。由表2可得，F=5030.293>F0.01（21，22）=2.74，即说明不同产地肾茶中总黄酮的含量差异极显著。

2.10 样品不同部位测定 按照上述方法，分别测定了5批样品的茎和叶总黄酮的含量，按干燥品计算，结果见表3。由表4可得，F=28390.505> F0.01（9，10）=4.95，即说明不同地区肾茶不同部位总黄酮的含量差异极显著。

3 讨论

3.1 试验条件的考察 试验采用分光光度法以芦丁为对照品，以相应的试剂为空白，分别考察溶剂：甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇；提取方式：回流提取（提取时间分别为60 min、120 min、180 min；回流温度分别为75 ℃、85 ℃、95 ℃）；超声处理（超声时间分别为30 min、45 min、60 min）、振摇提取（振摇时间为120 min温度为65 ℃）、取样量（0.12 g、0.25 g、0.50 g）制备的供试品溶液，在500 nm波长处测定吸光度，计算总黄酮的含量。结果表明，取样量为0.12 g，50%乙醇为溶剂85 ℃回流提取，肾茶中总黄酮的溶出量最大，回流时间60 min、120 min、180 min肾茶中总黄酮的溶出量变化不大，选择取样量为0.12 g，以50%乙醇为溶剂，提取温度为85 ℃回流60 min制备供试品溶液。

3.2 单因素方差分析 目的是通过分析各样本之间的差异，来检验各样本总体效应之间的差异，从而确定该因素对试验结果是否有显著性影响。由表2可得，F=5030.293>F0.01（21，22）=2.74，即说明不同产地肾茶中总黄酮的含量差异极显著。由表4可得，F=28390.505>F 0.01（9，10）=4.95，即说明不同地区肾茶不同部位总黄酮的含量差异极显著。

肾茶含有的甲氧基黄酮类，药理研究表明[6-15]具有明显的抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节及保护心血管作用，肾茶为西双版纳傣族自治州的傣族常用药物，平时代茶饮，用于治疗肾炎、肾结石等疾病，深入研究其质量控制方法显得尤为重要。本实验结果显示不同产地肾茶总黄酮含量差异极显著，不同部位（茎、叶）总黄酮含量差异极显著。本研究建立了分光光度法法测定肾茶中总黄酮的含量，此方法简便、快速、准确，经方法学验证，可作为检验肾茶中总黄酮的含量的一种手段，为肾茶药材的进一步研究提供方法依据。

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