蜜蜂蜂毒对大鼠急性血瘀证的影响

何亚楠 张枝雪 高源 赵海荣 巫秀美 武琦梅 何苗

【摘 要】 目的：观察蜜蜂蜂毒（Bee venom，BV）对大鼠急性血瘀证的影响。方法：以皮下大剂量注射盐酸肾上腺素（Adrenalin hydrochloride，A）后再施以冰水游泳复制急性血瘀模型。通过测定血液流变学、凝血四项、纤溶活性等各项指标评价BV对大鼠急性血瘀证的影响。结果：与NS模型组比较，BV中剂量组不同切变率的全血粘度均显著降低（P<0.05或P<0.01）；BV高、中、低剂量组血浆粘度、红细胞聚集指数、卡松粘度均有降低趋势；BV高、低剂量组PT、APTT有延长趋势，中、低剂量组TT有延长趋势；BV中剂量组可显著降低FIB含量（P<0.01）。结论：BV具有改善大鼠急性血瘀证的作用，其机制与降低血液粘度、FIB含量有关。

【关键词】 BV；急性血瘀证；血液流变学；凝血四项

【中图分类号】R965 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）11-0010-04

Abstract：Objective To observe the effects of BV on acute blood stasis syndrome in rats.Methods The acute blood stasis model was replicated by swimming with ice water after injection of Adrenalin hydrochloride （Adrenalin hydrochloride， A） with high dose of subcutaneous injection. The effect of BV on acute blood stasis syndrome of rats was evaluated by measuring hemorheology， four blood clotting items and fibrinolytic activity. Result That compared with NS model group， BV middle dose group in different shear rate of whole blood viscosity decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）； BV high， medium and low dose group of plasma viscosity， erythrocyte aggregation index and Casson viscosity all decreased； BV high and low dose group PT， APTT had a increasing trend， medium and low dose group， TT had a increasing trend； BV middle dose group could significantly reduce the content of FIB （P<0.01）. Conclusion BV has the effect of improving the syndrome of acute blood stasis in rats， and its mechanism is related to the reduction of blood viscosity and the content of FIB.

Keywords：Bee Venom； Acute Blood Stasis Syndrome； Hemorheology； Four Blood Clotting Items

血瘀證是中医临床常见的证候类型之一，形成的原因主要有外伤、寒邪、郁怒、气虚、血虚、阴阳虚等[1]。血瘀证是脑缺血的基础证型，中医常用活血化瘀疗法治疗脑缺血。蜜蜂蜂毒为蜜蜂科昆虫中华蜜蜂等的工蜂尾部螫刺腺体中排出的毒汁，中医药及民间医药均有很长的使用蜂毒治疗疾病的历史，其具有祛风湿、止痛的功效，用于治疗风湿性关节炎，腰膝酸痛，坐骨神经痛等。现代研究发现，BV具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗辐射、抗血小板聚集等作用。临床用于治疗各种神经炎、风湿性关节炎及心血管等多种疾病。据报道[2-3]，BV至少有14个生物活性肽，如melittin、apmin、sceapin 、peptide-401等，且均具有较强的药理作用和生物活性[4-8]，其具活性成分主要有活性酶类、多肽类、糖类、脂类、氨基酸类和胺类物质等。其中，melittin可抗血小板聚集、延长小鼠体外凝血时间；apmin则可以通过血脑屏障，直接作用于中枢神经系统[9]。中医常用活血化瘀法治疗脑缺血，而蜂毒体外具有很强的抗凝血作用[10]，本研究旨在通过建立动物血瘀模型，考察其是否具有活血化瘀的作用。基于蜂毒主要成分为多肽及酶类成分，口服往往无效而注射给药存在很大的致敏风险，本试验依据传统中医经皮给药途径，将BV制备成涂膜剂进行考察，以大鼠急性血瘀模型作为观察对象，以血液流变学、凝血四项、纤溶活性等临床常用的客观指标作为评定手段，系统地观察BV经皮给药对血瘀证的影响，初步探讨BV经皮给药的活血化瘀作用。

1 仪器与材料

1.1 药物试剂 盐酸肾上腺素（批号：10150902，上海禾丰制药有限公司）；氢化可的松（批号：1501271，天津金耀药业有限公司）；水合氯醛（批号：20120827，天津市光复精细化工研究所）；硫酸阿托品注射液（批号03141205，上海禾丰制药有限公司）；薇婷脱毛膏（批号：J20140017，利洁时家化（中国）有限公司）；蜜蜂蜂毒（BV）（批号：20150307，大理大学药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心提供），使用前，依据工艺制备成涂膜剂给药。

1.2 仪器 SA-7000型全自动血液流变测试仪（北京赛科希德科技发展有限公司）；CA-620型全自动凝血分析仪（上海希森美康医用电子有限公司）。

1.3 实验动物 成年健康雄性（Sprague Dawley，SD）大鼠，体重250～300 g，SPF级，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK（湘）2011-0003。25℃室温喂养，给予大鼠专用标准饲料、纯净水，自由取食饮水。所有实验研究符合中国伦理委员会有关动物研究指导原则。

2 方法

2.1 急性血瘀模型复制 健康SD雄性大鼠60只，体重250～300 g，随机分为6组，每组10只。即正常对照组、NS模型组、醒脑静注射液组（1.68 mL/kg·BW）、BV高、中、低剂量组（6.40、3.20、1.60 mg/kg）。各组动物于给药前日，用人用脱毛膏于太阳穴两侧局部脱毛。正常对照组正常饲养；NS模型组、醒脑静注射液组肌肉注射给药；BV组将涂膜剂均匀涂敷于两侧太阳穴，每侧0.03 mL；涂膜剂涂抹后要待水分挥发后形成薄膜，保持10 min左右后放回笼盒；重复给药前应用蘸生理盐水的棉签轻轻擦去残留的薄膜，每天给药1次。预防给药5 d，末次给药后1 h，参考文献[11-12]方法，除正常对照组外，其余各组大鼠皮下注射A 0.8 mL/kg·BW每次，共2次，间隔时间为4 h，第1次皮下注射A 2 h后，将大鼠置于4 ℃冰水中游泳5 min，2 h后第2次皮下注射A，造成急性血瘀证模型。

2.2 血液采集及指标测定 急性血瘀各组动物于第2次皮下注射 A 24 h后取血。以10%水合氯醛0.35 mg/kg·BW腹腔注射麻醉，腹主动脉快速取血6 mL，其中4 mL用肝素抗凝，采用全自动血液流变仪分别测定全血粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数和卡松粘度。另外2 mL用3.8%枸橼酸钠溶液与全血1：9抗凝，采用全自动凝血分析仪测定血浆纤维蛋白原（Plasma fibrinogen，FIB）、纤维蛋白降解产物（Fibrin degradation products，FDP）、血浆D-二聚体（D-dimer，D-D）、活化部分凝血活酶时间（Activated partial thromboplastin time，APTT）、血浆凝血酶原时间（Plasma prothrombin time，PT）、血浆凝血酶时间（Thrombin time，TT）。

2.3 数据处理与统计分析 数据采用SPSS 21.0统计软件进行统计描述和统计分析，以均值加减标准差表示，数据符合正态性且方差齐的，采用参数检验中的单因素方差分析（one-way ANOVA）比较，组间两两比较采用LSD（最小显著差检验），数据不符合正态性或方差不齐的采用非参数检验中的Kruskal-Wallis 检验分析比较，以P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 BV对急性血瘀大鼠全血粘度的影响 经单因素方差分析，与正常对照组比较，NS模型组不同切变率全血粘度显著升高（P<0.01）；与NS模型组比较，醒脑静组可降低切变率为1/s、10/s和60/s的全血粘度（P<0.05）；BV中剂量组不同切变率的全血粘度均显著降低（P<0.05或P<0.01），且切变率为1/s、10/s的全血粘度效果显著优于醒脑静组（P<0.05）。见表1。

3.2 BV对急性血瘀大鼠血浆粘度、红细胞聚集指数和卡松粘度的影响 经单因素方差分析，与正常对照组比较，NS模型组大鼠血浆粘度、紅细胞聚集指数、卡松粘度显著增加（P<0.01）；与NS模型组比较，BV涂膜剂中剂量组血浆粘度、红细胞聚集指数、卡松粘度均显著降低（P<0.05或P<0.01），且血浆粘度、红细胞聚集指数效果显著优于醒脑静组（P<0.01或P<0.05）。见表2。

3.3 BV对急性血瘀大鼠PT、APTT和TT的影响 经Kruskal-Wallis 检验，与正常对照组比较，NS模型组仅TT存在统计学差异（P<0.05）；与NS模型组比较，所有给药组PT、APTT及TT均无统计学差异（P>0.05）。提示BV经皮给药对急性血瘀大鼠凝血时间的影响并不明显。见表3。

3.4 BV对急性血瘀大鼠FIB、FDP和D-二聚体的影响 经单因素方差分析，与正常对照组比较，NS模型组大鼠血浆FIB、FDP、D-二聚体含量显著增加（P<0.01）；与NS模型组比较，BV中剂量组可显著降低FIB含量（P<0.01），且效果显著优于醒脑静组（P<0.01），BV涂膜剂高、低剂量组有降低FDP和D-二聚体含量的趋势。见表4。

4 讨论

除传统的活血化瘀中药外，近现代药理研究的许多动物药针对心脑血管疾病均有显著的治疗作用，如水蛭[13]、蚯蚓[14]、蛛毒[15]、蛇毒[16]及昆虫毒素[17-20]等。在部分药用植物资源不足的情况下，这些动物资源可能是以后心脑血管疾病新药研发的重点来源。

实验借助“郁怒”和“寒邪”两个病因，通过注射大剂量A模拟人暴怒时的机体状态，施以冰水游泳，模拟“寒邪”入侵，二者共同作用来复制大鼠急性血瘀证。实验过程中由于麻醉、低温、游泳疲劳，部分大鼠状态较差，有死亡。结果显示，除了凝血系统相关的PT和APTT两个指标基本无差异外，NS模型组的血液流变学、纤溶活性等相关指标均与正常对照组存在统计学差异，提示皮下注射盐酸肾上腺素伴以4℃冰水游泳可以有效复制大鼠血急性瘀证模型。阳性药醒脑静注射液可降低部分血粘度，与文献报道一致[21]。与模型组比较，BV可降低血瘀大鼠全血粘度、血浆粘度及卡松粘度，提示BV能有效改善急性血瘀大鼠的血流变性；与模型组比较，BV中剂量组可显著降低FIB含量（P<0.01），其他两个剂量组亦有降低趋势，提示BV能有效缓解急性血瘀模型大鼠的血液高凝状况。结果表明，BV能显著降低急性血瘀模型大鼠的全血粘度、血浆粘度、卡松粘度，有效改善血瘀状况，但对内源性（APTT）及外源性（PT）的凝血途径均无明显影响。其可能通过血瘀状态下，有效抑制凝血因子FIB的生成而发挥作用。此外，BV能改善模型大鼠的血液流变性，但没有明显剂量依赖关系，推测原因可能与BV涂膜剂为多组分混合物及透皮吸收相关，笔者将在后续实验中进一步深入研究。

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