HPLC法同时测定鼠曲草不同部位中3种黄酮类成分含量

卢晓艺 华丽萍 李煌 徐伟 褚克丹 叶向丽

【摘 要】 目的：建立同时测定鼠曲草不同部位3种黄酮类化合物（槲皮素、木犀草素、芹菜素）含量的高效液相色谱法。方法：采用Diamonsil-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱，流动相：甲醇-0.2%磷酸（50∶50），等度洗脱，流速：1 mL/min，检测波长：360 nm。结果：槲皮素、木犀草素、芹菜素的进样量分别在0.122～2.434、0.147～2.940、0.094～1.880 μg范围内与各自峰面积呈良好线性关系，r分别为0.999 4、0.999 7、0.999 6，方法的精密度、重复性均满足分析要求，方法的回收率均大于98%。结论：该方法简单、快速、高效，可用于鼠曲草不同部位中3种黄酮类化合物的含量测定。

【关键词】 鼠曲草；不同部位；槲皮素；木犀草素；芹菜素

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）03-0036-04

Abstract：Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for simultaneous determination of three flavonoids （quercetin， luteolin， apigenin） in different parts of Gnaphalium affine D.Don. Methods Diamonsil - C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） column was adopted. The mobile phase was methanol-0.2% phosphoric acid （50∶50） solution with the isocratic elution at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃ and the detection wavelength was 360 nm. Results There was a good linear relationship between content and peak area when the quercetin， luteolin and apigenin were within the range of 0.122 ～ 2.434（r= 0.9994）， 0.147 ～ 2.940（r= 0.9997）， 0.094 ～ 1.880μg（r= 0.9996）.The performance characteristics of precision and reproducibility of the developed HPLC method fulfilled the analysis requirements.Conclution The method is simple， rapid and efficient， and applicable for determination of three flavonoids in different parts of Gnaphalium affine.

Keywords：Gnaphalium Affine； Different Parts； Quercetin； Luteolin；Apigenin

鼠曲草又名佛耳草、清明菜、白艾，系菊科鼠曲草屬植物Gnaphalium affine D.Don，全草入药，收载于1977年版《中华人民共和国药典》一部中[1]。多生于路旁、田边、山坡草地等处，我国黄河流域以南各省区均有分布，也见于墨西哥、阿根廷、危地马拉、玻利维亚等中南美洲国家。据报道，鼠曲草全草中含有5%黄酮苷[2]，是鼠曲草主要的活性成分。黄酮类化合物药理活性丰富，具有抗菌抗氧化[3-7]、改善糖尿病血脂紊乱[8]、止咳祛痰[9]、保肝[10]、镇痛[11]、抗炎[12-14]，改善气道炎症[15]和胶原诱导的关节炎症状[16]的作用，对高尿酸血症和痛风性关节炎[17]也有一定的治疗作用等，在南非国家用鼠曲草来治疗呼吸道和肠胃道疾病[18]。

本研究拟采用高效液相色谱技术，建立同时测定鼠曲草中槲皮素、木犀草素和芹菜素的检测方法，并将该方法应用于鼠曲草不同部位中3种黄酮类化合物的分析检测，为鼠曲草总黄酮和黄酮类化合物的开发利用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 材料 鼠曲草购自福建中医药大学承创堂，芦丁（≥98%，Rutinhydrate，批号：100080-201610，中国食品药品检定研究院）、槲皮素（≥98%，Quercetin，批号：C20J6Y1722，上海源叶生物科技有限公司）、木犀草素（≥98%，Luteolin，批号：C10016987，上海麦克林生化科技有限公司）、芹菜素（≥98%，Apigenin，批号：K27A6C1，上海源叶生物科技有限公司）。甲醇（色谱纯，德国默克公司）、磷酸（分析纯，批号：20160521，天津市恒兴化学试剂制造有限公司）、乙醇（分析纯，批号：20170311，国药集团化学试剂有限公司）、氢氧化钠（分析纯，批号：1404102，西陇化工股份有限公司）、亚硝酸钠（分析纯，批号：1608011，上海联试化工试剂有限公司）、硝酸铝（分析纯，厂家：天津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号：20160426）、Na2CO3（分析纯，批号：20130613，国药集团化学试剂有限公司），水为超纯水。

1.2 仪器 Ultimate-3000型高效液相色谱仪（美国戴安公司）、UV-1800紫外分光光度计（日本岛津）、KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、XS105型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）、HH-4数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Diamonsil-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：甲醇-0.2%磷酸（50∶50）；检测波长：360 nm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。理论塔板数按槲皮素、木犀草素、芹菜素峰计，应分别不低于5000、6000、7000。色谱图如图1所示。

2.2 测定波长的选择 将槲皮素、木犀草素、芹菜素分别溶解于甲醇中，使其浓度约为10 μg/mL，用紫外-可见分光光度计在190～400 nm的波长范围内进行扫描，得到吸收曲线如图2所示，因为考虑到同时检测，所以选择360 nm作为测定波长。

2.3 对照品溶液的制备 分别精密称取槲皮素6.08 mg于10 mL容量瓶、木犀草素1.47 mg于2 mL容量瓶、芹菜素2.35 mg于5 mL容量瓶，加甲醇溶解，定容置刻度线，得到浓度为0.608 mg/mL槲皮素、0.735 mg/mL木犀草素、0.470 mg/mL芹菜素储备液，再分别精密吸取1 mL上述储备液于5 mL容量瓶，加甲醇定容置刻度线，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液作为混合对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备[19] 分别称取5 g花、茎、叶、鼠曲草，按照料液比1∶35加入65%乙醇，超声波辅助提取两次（超声波功率350 W，提取温度35 ℃），每次35 min，合并提取液，过滤，浓缩，定容至25 mL容量瓶，摇匀，静置。经0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液，平行做三份供试品溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定槲皮素、木犀草素、芹菜素，以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得到3种成分的回归方程，相关系数与线性范围。见表1。

2.5.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，测得槲皮素、木犀草素、芹菜素峰面积的RSD分别为0.66%、0.64%、0.94%，表明仪器的精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，于室温放置 0、2、4、6、8、12、24 h，精密吸取 10 μL，按“2.1”项色谱条件进样分析，计算各色谱峰面积的RSD值，结果槲皮素、木犀草素、芹菜素各组分峰面积的RSD值分别为2.43%、2.87%、2.09%，均小于 3.0%，表明供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 称取同一样品5份，按照“2.4”项下的方法制備供试品溶液，并按“2.1”项下的色谱条件进样10 μL，测得槲皮素、木犀草素、芹菜素质量分数的RSD分别为1.59%、1.13%、1.89%，表明该方法重现性良好。

2.5.5 加样回收试验 精密称取已知含量的鼠曲草样品2.5 g 共6份，分别置250 mL具塞锥形瓶中，分别加入槲皮素、木犀草素和芹菜素的对照品溶液适量，按照“2.4”项下的方法处理样品，按“2.1”项下的色谱条件进行测定各待测成分的量，计算回收率与RSD值。回收率试验结果表明，槲皮素、木犀草素、芹菜素的平均回收率分别为99.18%、100.73%、98.70%，RSD值分别为： 1.92%、2.27%、2.56%。见表2。

2.6 样品测定 按照“2.1”项下的色谱条件对鼠曲草不同部位和全草中的槲皮素、木犀草素、芹菜素的含量进行测定。色谱图如图3所示，其结果见表3。

3 讨论

3.1 色谱条件的确定 将槲皮素、木犀草素、芹菜素配制成混合对照品，进行液相色谱分析，因3种黄酮均含有多个酚羟基，具有一定的酸性，为保证实验获得较好的峰形，采用一定浓度的磷酸调节流动相的PH值，改善分离效果。实验最终以0.2%磷酸溶液作为缓冲剂，可得到较好的色谱峰。实验以乙腈和磷酸作为流动相，但由于样品基质复杂，杂峰对上述3种化合物的峰有干扰且分离度没有达到规定要求，实验中发现甲醇-水体系较乙腈-水体系更有利于待测化合物的分离；所以选择甲醇-0.2%磷酸溶液作为洗脱剂；实验表明等度洗脱更有利于物质的分离，经过多次优化实验确定“2.1”项下所示的色谱条件。该条件既可缩短样品中槲皮素、木犀草素、芹菜素3种待测黄酮化合物的分析时间，又能达到较好的分离效果。

3.2 不同部位3种黄酮类化合物的含量测定 从表2和图3中数据可知，用HPLC法同时测定鼠曲草全草和花中3种黄酮类化合物，花和鼠曲草中槲皮素、木犀草素、芹菜素的含量均不相同，花中3种黄酮类成分的量均最高，同时其含量又是木犀草素>槲皮素>芹菜素，茎和叶中未检测出这3种成分或量过低没有达到检测限，从而推测鼠曲草中槲皮素、木犀草素、芹菜素这3种成分主要分布在花中。

我国鼠曲草资源丰富，分布广泛，可药食两用。鼠曲草中富含黄酮类成分，具有多种药理活性，是一种极具开发利用潜质的生物资源。但是目前国内对鼠曲草的研究较少，尤其是对鼠曲草的化学成分以及定量测定的研究相对较少，这是对鼠曲草利用价值的极大浪费。本实验利用HPLC法分析鼠曲草各部位中3种黄酮类成分的分布情况，方法学考察表明，所建立的方法线性关系和重复性良好，结果准确，可用于鼠曲草不同部位槲皮素、木犀草素、芹菜素的定量分析。

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（收稿日期：2017-12-13 编辑：程鹏飞）