赖氨酸表面修饰PVDF纳米纤维膜及其对胆红素的吸附性能

2018-09-18李胸有庄旭品

天津工业大学学报 2018年4期

李胸有，成强，董锋，张方，庄旭品

（1.中石化齐鲁分公司腈纶厂，山东淄博 255000；2.天津工业大学纺织学院，天津 300387）

随着生物工程和生命科学的迅速发展，对生物大分子分离纯化的要求越来越苛刻，发展新型高效的分离技术成为迫切需求[1].亲和膜分离技术（affinity membrane chromatography）是亲和色谱和膜分离技术结合发展起来的一项新型高效分离技术，该技术利用亲和配基修饰的多孔膜代替传统亲和色谱的凝胶，既能表现出亲和色谱的特异性和高选择性吸附等优点，又具有膜分离技术的操作条件温和、分离快速、无污染、易放大、可连续操作等优势，已应用于纯化分离蛋白质、酶和其他多种生物大分子[2]，显示出了极诱人的应用前景，相关研究十分活跃.

亲和膜是实现特异性吸附和快速分离的关键材料，通常是以多孔中空纤维膜或平板膜为基材，经活化、固载亲和配基而制得.近年来，将纳米纤维膜应用于亲和膜的研究受到了广泛关注.其内部贯通的孔隙结构和高比表面积使其特异性吸附不仅发生在纳米纤维膜表面纤维，而且存在于纤维之间的孔隙中，从而提高了其与目标分子的碰撞几率，体现出比传统亲和膜更加优异的性能[3-5].溶液喷射纺丝技术是一种利用高速气流对聚合物溶液细流进行超细拉伸而获得纳米纤维的高效制备技术[6-7].该技术凭借其制备的纳米纤维的三维卷曲性、纤维间孔隙率高等优势，近年来受到了国内外科研工作者的广泛关注.近期齐鲁石化腈纶厂与天津工业大学合作研发了溶液喷射纺丝中试设备，实现了纳米纤维的工程化生产，为纳米纤维在亲和分离领域的应用提供了良好的基础.

胆红素（bilirubin，BR）是一种内源性毒素，是血红素的代谢产物.当胆红素含量过高时，不仅会发生胆汁性肝硬化，溶血性黄痘等疾病，而且会影响到其他器官的功能[8-9].研究人员根据胆红素的结构特点研究了不同种类的亲和配基的吸附作用，结果表明聚赖氨酸[10]、氨基酸[11-13]、聚乙烯亚胺[14]、蛋白质（人血清白蛋白）[15]和汽巴蓝[16-18]等配基因含有氨基、羧基或羟基等活性基团表现突出，其中氨基酸由于其亲水性和多功能基团作为吸附介质引起广泛注意.

本文以溶液喷射纺PVDF纳米纤维为基质，通过亲水改性、偶联1，6-己二胺作为间隔臂后，固载含有胺基、羧基和疏水性长碳链的赖氨酸作为亲和配基制得PVDF纳米纤维亲和膜，将其用于吸附胆红素，并研究温度、时间和pH值对其吸附胆红素的影响.

1 实验部分

1.1 实验原料与试剂

聚偏氟乙烯（PVDF），商业原料，上海三爱富有限公司产品；N，N-二甲基乙酰胺，分析纯，天津光复精细化工研究所产品；赖氨酸，天津光复精细化工研究所产品；胆红素，上海笃玛生物科技有限公司产品；PBS缓冲液，北京索莱宝科技有限公司产品；其他的试剂均为天津科密欧有限公司产品.

1.2 PVDF纳米纤维膜的制备

本实验利用天津工业大学和齐鲁石化联合研制的溶液喷射纺丝中试设备纺制纳米膜.将一定质量的PVDF溶于N，N-二甲基乙酰胺和丙酮溶液（9∶1 v/v）中获得质量浓度为0.2 g/mL的纺丝溶液，主要纺丝参数为：牵伸风压为0.06 MPa，每喷孔溶液挤出速率为12 mL/h，成形距离为60 cm.制得的纳米纤维膜的定量为8 g/m2，60℃下真空处理6 h后，利用对辊热轧机在140℃、0.28 MPa下处理待用.

1.3 PVDF纳米纤维亲和膜的制备

将热轧处理后的PVDF纳米纤维膜在4%KMnO4和16.8%KOH混合液中80℃下处理30 min后浸于5%H2SO4和5%NaHSO3混合液中室温下处理，直至膜变白.然后将膜浸没在1.5%HEC和4%NaOH的混合溶液中90℃下处理15 min以增加反应基团和增强其亲水性.烘干后，将膜在4.2%的NaHCO3溶液中90℃下清洗，之后将连接HEC的膜浸于3.2%NaOH和环氧氯丙烷的混合液中60℃下活化1 h.为了偶联间隔臂，将活化后的膜在5%己二胺（HAD）溶液60℃下处理2 h.清洗后再次使用3.2%NaOH和环氧氯丙烷的混合液于60℃下活化1 h，最后，将活化改性后的膜浸没在0.3%的赖氨酸磷酸盐缓冲溶液中45℃反应24 h，获得PVDF纳米纤维亲和膜，清洗烘干后备用.

1.4 胆红素吸附实验

将20 mg的PVDF纳米纤维亲和膜浸没在10 mL质量浓度为1 mg/mL的胆红素溶液中，在一定条件下振荡处理，每隔一段时间取样测试，研究吸附时间、温度和pH值对吸附效果的影响.胆红素在太阳光或其他的光源下容易破环，本吸附实验在暗室中进行.

用酶标仪（北京普朗新技术有限公司，DNM-9602）测试胆红素的吸光度，依据胆红素浓度与吸光度的标准曲线计算出胆红素的浓度.纳米纤维膜对胆红素的吸附量通过公式（1）计算：

式中：q为单位无纺布的吸附量（mg/g）；Cb和Ca分别为吸附前后胆红素的质量浓度（mg/L）；V为胆红素溶液的体积（L）；m为无纺布的质量（g）.

1.5 测试与表征

将所制得的PVDF纳米纤维经过喷金处理后，通过Hitachi公司生产的S-480（Ⅱ）场发射扫描电子显微镜（SEM）观察样品的形貌.

利用孔径测定仪（PSM 165）测定膜的孔径，所测结果为不同大小的孔径所占比例，从而得出膜孔径大小的大致分布；利用全自动气体吸附分析仪测得膜的孔隙率.

膜的水通量采用低压平板膜实验设备（TYLG-18）测试，在不同压力下，记录一定体积的水通过一定膜面积所需的时间，计算出单位压力下，单位时间通过单位膜面积的水的体积即膜的水通量.

利用英国ThermoFisher公司生产的K-alpha型X射线光电子能谱（XPS）测试分析得到PVDFNM、PVDF-HEC和PVDF-HEC-Lys所含元素含量以及具有不同结合能的官能团所占比例.进一步对C1S特征峰分峰拟合，以分出的具有不同结合能的基团特征峰对应得峰面积来表示基团的相对比例，由此来间接检测活化改性的效果.

利用北京金盛鑫检测仪器有限公司的JYSP-180型接触角测试仪测试PVDFNM和PVDF-HEC的接触角，分析所测接触角的大小来评价膜的亲水性能.

2 结果与讨论

2.1 PVDF纳米纤维膜的形貌及特性

图1为利用溶液喷射纺丝技术制得的纳米纤维的扫描电镜照片.

图1 溶液喷射纺PVDF纳米纤维膜的扫描电镜图Fig.1 SEM figure of solution-blown PVDF nanofibers

从图1中可以看出，纤维呈三维卷曲形态，大部分纤维直径的变化范围为50～250 nm.纤维的卷曲形态使得膜具有高的孔隙率，测试结果为92.1%，纤维间孔隙大多小于2 μm，孔径分布如图2所示.图3为纳米纤维膜在不同压力下纯水通量变化图.

图2 溶液喷射纺PVDF纳米纤维膜的孔径分布图Fig.2 Distribution of pore sizes of solution-blown PVDF nanofibrous membrane

图3 溶液喷射纺PVDF纳米纤维膜的水通量图Fig.3 Tested flux of solution-blown PVDF nanofibrous membrane

由图3可以看出，其水通量先呈现快速上升趋势，当压力为0.34MPa时，水通量达到0.42mL/（cm2·s），趋于平衡，可以看出其纳米纤维膜的结构赋予其高通量的特性。

2.2 PVDF纳米纤维膜的改性

虽然PVDF纳米纤维膜易制备，具有优秀的耐化学性、良好的热稳定性和机械性能，以及在微滤、超滤和纳滤中被广泛应用，但是PVDF纳米纤维膜亲水性差，表面活性基团少，因此需要通过活化改性在膜上增加可反应的基团后，保证后续续偶联间隔臂和配基固载，从而确保配基与目标分子发生亲和作用[20].本文选择HEC改善膜的疏水性，通过观察反应前后接触角的变化来评价改善的效果.图4为改性前后PVDF纳米纤维的表面接触角测试结果.

图4 PVDF纳米纤维膜的接触角图Fig.4 Contact angles of membranes of PVDF

从图4（a）可以看出，PVDF纳米纤维膜的接触角为106°，并且30 s后接触角保持不变，如图4（b）所示.从图4（c）和（d）可以看出HEC优化的PVDF纳米纤维膜（PVDF-HEC）的接触角为35°并且30 s后接触角变为20°.偶联HEC前后，膜的接触角发生改变，由此证实HEC成功地改善了PVDF纳米纤维膜的疏水性.

图5所示为偶联赖氨酸的纳米纤维膜的XPS测试结果.由图5可以看出，PVDF-HEC和赖氨酸修饰的PVDF-HEC上的F元素含量均低于PVDF纳米纤维膜；而O元素的含量正好相反，产生此结果的原因是HEC增加了O元素的相对含量；XPS图谱中N元素的出现证实赖氨酸成功固载.此外，通过对Cls特征峰进行分峰拟合，进而分析了具有不同结合能的膜表面基团，并且利用基团对应的特征峰的面积来表达基团的相对比例，如图6所示.由图6可以看出，PVDF纳米纤维表面修饰改变了其表面组成。根据结合能分析其归属的特征基团，计算得到纳米纤维膜表面不同特征基团的含量，如表1所示.

图5 PVDF纳米纤维膜XPS测量光谱图Fig.5 XPS spectrum of PVDF nanofibrous membrane

图6 PVDF纳米纤维膜的XPS拟合曲线图Fig.6 Results of XPS peak-fitting of PVDF nanofibrous membrane

表1 PVDF纳米纤维膜表面基团分析结果Tab.1 Results of groups content according to XPS peak-fitting

从表1可以看出：相比PVDF纳米纤维膜，PVDFHEC和亲和膜中—CH2—CF2—和—CF2—含量降低，而—CH2—CH（OH）—的含量有大幅度的增加.而—COOH和—CH2—NH—的出现进一步证明了赖氨酸成功固载于膜表面.

2.3 吸附性能测试

亲和吸附是指配基能识别特定物质并与该物质进行可逆结合与解离，配基与相应的特定物质的相互作用称为亲和作用.亲和作用是生物分子间氢键、静电作用、疏水作用、分子间作用力（范德华力）等作用力的综合表现.膜上的配基与目标分子间的亲和作用而发生吸附现象即为特异性吸附.图7为PVDF纳米纤维亲和膜对胆红素的吸附性能测试结果.从图7中可以看出，PVDF纳米纤维亲和膜在10 h内呈现快速吸附的趋势，然后趋于平衡.PVDF纳米纤维亲和膜吸附量最高可达378.69 mg/g，可见PVDF纳米纤维表面偶联赖氨酸后，借助于氨基和胆红素的羧基的静电作用，其对胆红素的吸附性能大大提高.

图7 胆红素静态吸附结果图Fig.7 Effects of factors on BR adsorption of nanofibrous membrane

为了研究温度对膜亲和吸附胆红素的影响，分别在25℃和37℃下进行胆红素吸附实验.从图7（b）可以看出，PVDF纳米纤维亲和膜的胆红素吸附量随温度的升高而增加.然而，一般情况下，吸附随温度的增加而减少，胆红素吸附产生相反现象的原因可能是胆红素分子构象发生改变，致使胆红素与赖氨酸间的空间维位阻减小[21-23].此外，PVDF纳米纤维亲和膜在25℃和37℃下的胆红素吸附量分别达到365.53 mg/g和378.69 mg/g，从膜的胆红素吸附量可以看出PVDF纳米纤维亲和膜展现良好的吸附效果.

从图7（c）可以看出，pH值对PVDF纳米纤维膜吸附胆红素也有一定的影响.当pH值为6.86、7.14和9.18时，PVDF纳米纤维亲和膜对应的胆红素的吸附量分别为342.82 mg/g、378.69 mg/g和324.07 mg/g.当pH值在6.86～7.14之间时，分子内氢键逐渐遭到破坏，胆红素的溶解度随之增大，PVDF纳米纤维膜的胆红素吸附量也就随之增大.然而，当pH值为9.18时，一方面胆红素解离出更多的羧基，致使胆红素分子带有大量负电荷，而亲和膜配基赖氨酸上的羧基也会发生解离，在膜的表面形成负电荷，致使赖氨酸配基与胆红素分子间产生静电排斥，导致胆红素吸附量降低.也可说是赖氨酸配基在pH值为9.18的缓冲溶液中带有负电荷形成的“离子氛”[24]与胆红素分子（胆红素的pKa为4.2～4.9[25]）周围的离子氛发生强烈的静电作用，致使膜的胆红素吸附量降低.