脱氢表雄酮对猪肝肾的亚慢性毒性作用

姜锦鹏, 解文军, 黄建飞

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)是肾上腺、性腺等组织分泌的类固醇产物，也是血液循环中最丰富的固醇类物质。研究表明, DHEA不仅是合成性激素的前体物质，还参与独特的生物学活动如降脂、抗癌、抗氧化、抗衰老、调节免疫等[1]。目前，一些国家已将DHEA用于临床，其中北美、日本等国已将DHEA作为膳食补充剂。近年来，DHEA因具有生物学活性，引起了畜牧兽医领域的广泛关注。并在动物生产上取得了进展，如发现DHEA具有促进畜禽的脂质代谢、改善畜禽肌肉品质，增强动物自身免疫力等功效[2-3]。虽然众多研究表明生理剂量的DHEA对动物和人体有多种益处，其毒副作用也不明显，但长期或大剂量使用DHEA可能存在安全问题[4]。相关资料表明高剂量DHEA能够增加SD大鼠肝脏和肾脏的重量[5]，并对一些实验动物有致癌作用[6]。本实验室已有研究表明，高剂量DHEA对生长期小鼠的睾丸组织发育有毒性作用[7]，因此，DHEA的安全性仍需进一步研究。因猪的消化系统、内分泌系统和代谢过程等许多生理学特点与人有高度的相似性，可作为研究人类一些疾病和药物安全性的良好动物模型[8]。因此，本试验通过添加不同剂量的DHEA的饲养商品猪，观察选择以生长育肥期去势公猪的肝脏、肾脏为研究对象，观察DHEA对其亚慢性毒性作用。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲养管理

本试验选择45头98日龄前后、体重相近的健康杜×(长·大)去势公猪，由安徽省怀远县淮河种猪养殖有限公司提供。DHEA购自常州佳尔科药业集团有限公司产品，纯度大于99%。选择98日龄、体重为45 kg左右的杜×(长·大)三元杂交去势公猪45头，随机分为3组，每组15头，组内设3个重复，每个重复5头。对照组饲喂基础饲料(表1)，试验Ⅰ组、Ⅱ组在基础饲料中分别添加25和75 mg/kg DHEA。试验猪以重复为单位分舍圈养，圈舍均为南向，面积为12.6 m2。预试期7 d，试验期105 d。试验前，将猪舍内外环境彻底清理消毒。试验期间，猪自由采食和饮水，每天喂料3次，早、中、晚各一次。常规饲养管理，定期对猪舍进行消毒和清理粪便，保持舍内清洁卫生，通风良好，并严格按猪场常规程序进行驱虫和免疫。试验期间每日观察猪的健康情况、活动、饮水采食等一般状况。

表1 基础饲料营养水平

1.2 样品采集

试验结束时，按组间体重相近原则从每组各选择6头猪进行屠宰。宰前由前腔静脉采集血样，分离血清后置于冰箱保存，用于生化指标的检测。宰后，分离并称量肝脏、肾脏重量，采集肝脏与肾脏组织样，置于体积比为4%的甲醛溶液中固定待测。

1.3 测定项目及分析方法

1.3.1 肝肾重量 屠宰后分别称量左右胴体重，小心剥离并取出肝脏和左侧肾脏，滤纸吸干表面水分后称重，并计算相对重量。肝脏相对重量(g/kg)=肝脏重量(g)/胴体重量(kg)，肾脏相对重量(g/kg)=左侧肾脏重量(g)/左侧胴体重量(kg)。

1.3.2 血清生化指标 血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase，ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase，AST)活性测定分别采用速率法、连续监测法。血清总蛋白(Total protein，TP)和白蛋白(Albumin，ALB)含量分别采用双缩脲法和溴甲酚绿法测定。血清肌酐(Creatinine，CREA)和尿素氮(Urea nitrogen，UREA-N)含量分别采用碱性苦味酸法、邻苯二甲醛法测定。血清ALT、AST、TP、ALB、CREA和UREA-N测定试剂盒均购自上海荣盛生物技术有限公司。以上指标均使用全自动生化分析仪(HITACHI 7080，株式会社日立科学系统)测定。血清球蛋白(Globulin，GLB)含量以及白/球比(A/G，其中A表示ALB，G表示GLB)按以下公式计算：GLB(g/L) = TP-ALB，A/G = 白蛋白/球蛋白。

1.3.3 肝肾组织切片制作 肝、肾组织固定24 h 后，乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋(YB-6型包埋机，湖北孝感亚光医用电子技术研究所)，用切片机(Leica RM2128，德国徕卡显微系统有限公司)进行组织切片，切片厚度约为6 μm，HE 染色，中性树胶封片，采用Olympus CH-30显微摄影系统(奥林巴斯株式会社)观察并拍照。

1.4 数据处理

试验数据采用SPSS 18.0软件进行统计分析，以“平均值±标准误差”表示。差异显著性检验采用独立样本t检验和单因子方差分析(One way ANOVA，LSD)，差异显著性标准为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 猪的一般状况与肝肾重量

各试验组猪在105 d喂养期间没有死亡,皮毛顺滑，活动自如，采食饮水正常，生长发育状况良好。由表2可见，与对照组相比，DHEA处理使猪的肾脏重量虽有所增加，但差异不显著(P>0.05)；DHEA低剂量组(试验Ⅰ组)的肝重也无明显变化(P>0.05)，但DHEA高剂量组(试验Ⅱ组)肝脏绝对重、相对重分别比对照组增加了18.6%和17.23%，差异均显著(P<0.05)。

表2 日粮添加DHEA对猪肝肾重量的影响

注：同列数据肩标没有字母或相同字母者表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字者表示差异显著 (P<0.05)。下同。

Note：Values in the same column with the same letters and no letters represent non-significant difference (P>0.05); Values in the same column with the different small letters mean significant difference at levels of 0.05 (P<0.05).The same below.

2.2 猪的肝肾功能

由表3可见，饲料中添加不同浓度的DHEA饲喂105 d后，对去势公猪血清ALT和AST活性无显著影响(P>0.05)，对血清TP、ALB和GLB含量以及A/G也没有明显影响(P>0.05)；与对照组相比，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组血清CREA和UREA-N水平均无显著性变化(P>0.05)。

表3 日粮添加DHEA对猪肝肾功能指标的影响

续表3

2.3 猪的肝肾组织病理性观察

屠宰时，肉眼观察试验组和对照组猪肝脏与肾脏的形态、色泽及质地未见明显变化，但试验Ⅱ组猪的肝脏肥大。试验Ⅰ、Ⅱ组猪的肝脏、肾脏组织经显微镜检查未见特征性病理变化(图1)。

图1 猪肝脏和肾脏组织病理学变化(HE染色)

3 结论与讨论

近年来，由于DHEA能参与机体一系列重要的生理活动，日益受到人们重视，但其副作用尚未完全厘清，必须考虑其使用上的安全性。DHEA的安全性与使用剂量和时间有关[7]。DHEA作为膳食补充剂，人的每日口服剂量范围通常在25～50 mg之间[9]。本试验采用与人体用量基本相当的剂量，以猪作为模型动物，观察亚慢性毒性。试验结果表明，去势公猪采食添加25、75 mg DHEA/kg饲料105 d，活动、采食、生长发育等一般状况未见明显异常，血清肝功能和肾功能指标与对照组没有明显差异。但是当日粮DHEA添加剂量达到75 mg/kg时，引起试验猪肝肾重量增加，其中肝脏绝对重和相对重明显增加(P<0.05)。陈冠敏等[5]发现，大鼠采食含有42 mg DHEA/kg的日粮90 d，就可增加肝/体比，在含量达到84 mg/kg 时同时增加雌性大鼠肾/体比。外源性添加DHEA导致肝细胞肥大可能与肝细胞内过氧化酶体增生有关[10]，但其原因还有待进一步研究。

肝脏组织病理学检查显示，对照组及DHEA处理组肝组织中有部分红细胞沉积，这与肝的造血和贮血功能有关[11]，也可能由于屠宰时未充分放血，导致血液在肝组织内滞留所引起。此外，未见其他明显的病理损伤。在本试验中，日粮添加75 mg/kg DHEA可引起肝重增加，但衡量肝脏功能的一些重要指标，如血清ALT和AST活力，白蛋白与球蛋白的含量及肝脏的组织结构并没有发生明显改变。说明DHEA对去势公猪肝脏功能无明显影响。

本试验中，肾脏病理组织学切片未见特征性病理变化。血清UREA-N 和CREA水平在一定程度上反映了肾脏的健康情况，表现了肾功能的受损程度[12]。参考有关资料中猪的血尿素氮(3.0～8.5 mmol/L)和肌酐(90～240 μmol/L)的正常生理范围[13]，可见本试验中被检的18头试验组去势公猪的相应值均为正常。以上结果表明，饲料中添加正常剂量DHEA对去势公猪肾功能无明显影响。另有研究显示DHEA对一些损伤反而具有一定的修复和治疗作用。Brignardello等[14]研究DHEA对高血糖所致大鼠肾小球细胞损害的影响，结果显示DHEA浓度为100 nmol/L和500 nmol/L时，可以逆转高糖所致的肾小球细胞损害。

综上所述，本试验结果表明DHEA对猪的血清肝功能和肾功能指标无不良影响，肝肾组织病理学检查也未见普遍性的特征性病变，但大剂量能引起猪肝脏重量增加。故DHEA低剂量使用较为安全，而在体内达一定剂量时并长期使用对猪肝脏有一定的亚慢性毒性作用。