野生黑豆和栽培黑豆对深层发酵灵芝酸产量的影响

王松华, 吴世良

(安徽科技学院 生命与健康科学学院, 安徽 凤阳 233100)

灵芝是一种食药两用大型真菌，在亚洲地区有着2 000多年的应用历史。现代生物学已证明灵芝子实体、孢子粉和菌丝体中含有多糖类、三萜类、甾醇类、有机锗等天然产物，其中灵芝酸是其主要活性成分，具有抗肿瘤、抗衰老、抗氧化等广泛药理作用，有着很高的药用价值和广阔的应用前景[1]。目前，提取灵芝酸主要原料为灵芝子实体，野生灵芝资源日渐稀少，且人工栽培灵芝子实体生产周期长、劳动强度大、生长条件与产品质量不易控制等。采用深层发酵培养灵芝菌丝体的方法来获得灵芝酸，具有周期短、质量易控、含量高等特点[2]而受到越来越多的关注。然而，产量偏低的问题仍是限制灵芝深层液体发酵规模化工厂的生产。研究表明，在培养基中添加一定浓度的油酸、水杨酸、乙烯、茉莉酸、一氧化氮、钙离子、铜离子和钠离子等物质均可一定程度提高灵芝酸含量[3-5]。

尽管这些信号分子能够提高灵芝酸含量，但有些却抑制灵芝菌丝体的生长，降低其生物量，对工业上的重要指标灵芝酸产量不一定会有增加效果。Gu等研究发现，一氧化氮供体0.5 mmol/L SNP处理时显著抑制灵芝菌丝生长(29.7%)[6], 灵芝酸含量增加率则仅为42.5%，对灵芝酸产量无显著影响；1 mmol/L Cu、80 mmol/L Caffeine 和20 mmol/L NaF处理灵芝菌丝时，虽然能够提高灵芝酸含量，但显著抑制菌丝体的生长。本文研究了在液体培养基添加适量的野生黑豆和栽培黑豆粉末既可有效提高灵芝菌丝体生物量，又可以显著提高灵芝酸含量，从而显著增加灵芝酸产量。

1 材料与方法

1.1 材料

灵芝菌种(Ganodermalucidum)由上海农科院食用菌研究所提供。

1.2 仪器与设备

JA2003N型电子分析天平、756-MC型可见分光光度计、YXQ-LS50S11立式压力蒸汽灭菌器、HZ-300L恒温摇床、HHoB11o420-S电热恒温培养箱、TGL-16G高速台式离心机、HH-6恒温水浴锅，SW-CJ-2FD双人单面净化工作台、XHF-D高速分散器、北京博医讯冷冻干燥机。

1.3 菌种培养与处理

灵芝菌种(Ganodermalucidum)在斜面培养基(马铃薯200 g、蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、琼脂 15 g/L)中保存；接种至种子液培养基(马铃薯200 g、KH2PO41 g/L、MgSO41 g/L、酵母浸出粉10 g、蛋白胨10 g、葡萄糖20 g)培养种子液；接种在液体培养基(KH2PO41 g、MgSO41 g/L、葡萄糖20 g、蛋白胨10 g)进行发酵，接种量5%；摇瓶条件：三角锥形瓶250 mL，装液量100 mL；发酵条件：温度28 ℃，转速150 rpm，培养时间7 d。

1.4 黑豆的处理

黑豆粉过40目筛筛选，50 ℃烘干， 35 ℃干燥保存。

1.5 生物量测定

发酵液6 000 rpm 10 min，弃上清，将沉淀于-50 ℃真空冷冻干燥至恒重，准确称取干菌丝体生物量。

1.5 灵芝酸提取与测定

称取干燥的灵芝菌丝体0.1 g， 10 mL 100%乙醇，常温超声3 h，6 000 rpm 20 min，取上清5 mL，重复浸提3次，合并上清，于45 ℃减压去乙醇。30 mL氯仿分3次将样品溶出，用饱和NaHCO3溶液(VNaHCO3∶V提取液)= 1∶2 萃取3次，收集NaHCO3层，用6 mol/L HCl调 pH值至3～4，用氯仿(VCHCl3∶VNaHCO3= 1∶2)萃取3次，减压蒸干氯仿，用乙酸乙酯溶出。然后按照标准绘制标准曲线，并计算灵芝酸含量及产量。

1.6 标准曲线

准确称取熊果酸标准品5.0 mg，溶于50.0 mL乙酸乙酯，混匀得标准溶液(100 mg/L)。取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，分别置于带盖试管，加热挥发溶剂，加入现配制的0.40 mL 5%香草醛-冰乙酸和1.0 mL高氯酸，在65 ℃加热15 min，冷却至室温，加入5.0 mL冰乙酸，摇匀，室温静置15 min，于547.5 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。标准曲线方程为：y=0.008 8X+0.079 7，R2=0.999 3。

1.7 数据处理与统计分析

统计分析使用SPSS 10进行处理。

2 结果与分析

2.1 栽培黑豆对灵芝深层发酵的影响

将不同浓度(2、4、6、8、10 g/L)栽培黑豆粉分别加入扩大培养基中，培养7 d收获。与对照组相比，试验浓度范围内的栽培黑豆粉能够显著地提高灵芝菌丝体干重、灵芝酸含量与产量(图1～3)。当培养基中栽培黑豆浓度达到8 g/L，灵芝菌丝体干重与2、4、6 g/L试验组相比显著提高，达到了9.068 g/L，为对照组的1.66倍。

培养基中添加2 g/L栽培黑豆粉，其灵芝酸含量与对照组相比显著增加，栽培黑豆添加浓度为4、6、8、10 g/L时，灵芝酸含量极显著(P<0.01)增加，分别是对照组的1.31、1.57、1.57、1.59倍；6、8、10 g/L试验组间灵芝酸含量组间无显著差异(P>0.05)。灵芝酸产量随栽培黑豆浓度变化趋势与含量相同， 8 g/L试验组灵芝酸产量较对照组提高162%。

图1 不同浓度栽培黑豆对灵芝菌丝生物量的影响

2.2 野生黑豆对灵芝深层发酵的影响

野生黑豆粉末按不同浓度加入扩大培养基，培养7 d后收获(图4～6)。与对照组相比，培养基中野生黑豆浓度2 g/L试验组的菌丝体生物量和灵芝酸产量无显著差异；扩大培养基中添加4、6、8、10 g/L野生黑豆浓度时，可以极显著(P<0.01)提升菌丝体生物量、灵芝酸含量和灵芝酸产量，其中菌丝体生物量分别为对照组的1.86、2.02、2.17、2.25倍，灵芝酸含量分别为对照组的1.38、1.69、1.65、1.73倍。灵芝酸产量随培养基中野生黑豆浓度变化趋势与灵芝酸含量相同，10 g/L野生黑豆浓度试验组灵芝酸产量最高，达到461.911 mg/g，比对照组灵芝酸产量提高了2.89倍。培养基中野生黑豆浓度为6、8、10 g/L试验组之间灵芝菌丝体生物量、灵芝酸含量、灵芝酸产量无显著差异(P>0.05)，这表明高浓度野生黑豆并不能显著提高灵芝菌丝体生物量，培养基中氮元素的增加对灵芝酸无显著诱导作用，可能是黑豆的其他活性物质具有诱导效应。

对比两种黑豆粉末对灵芝深层发酵的影响可以看出(图1～6)，相同浓度的野生黑豆粉末对灵芝酸合成的诱导作用比栽培黑豆更强。培养基中野生黑豆浓度为4 g/L时，灵芝酸含量为对照组的178%，是相同浓度栽培黑豆试验组的136%。添加4、6、8、10 g/L野生黑豆粉试验组之间灵芝酸产量无显著差异，但均显著高于对照组和相同浓度栽培黑豆试验组。

图3 不同浓度栽培黑豆对灵芝酸产量的影响

图5 不同浓度野生黑豆对灵芝酸含量的影响

图6不同浓度野生黑豆对灵芝酸产量的影响

Fig.6 Effects of wild black beans at various concentrations on the yield of ganoderic acid

3 结论与讨论

黑豆富含蛋白质，为微生物提供优质的氮源，并含有菌丝体生长必需的生长因子和微量元素。黑豆含有的维生素A是灵芝无法自身合成的物质，有研究表明适当加入维生素A能够提高灵芝深层发酵灵芝酸产量[7-8]。此外，黑豆含脂肪，可以修饰膜组合物和增加其通透性，或直接影响参与灵芝酸生产的酶合成水平，从而促进真菌代谢产物的产出。灵芝酸作为真菌代谢产物的一种应能受其刺激机制而增加产出[9]。本研究表明，培养基普通黑豆浓度为8 g/L时，菌丝体干重提高1.66倍，达到9.068 g/L。培养基野生黑豆浓度为4 g/L时可显著提高菌丝体干重225%，达到了11.980 g/L。使用黑豆优化培养基，可以提高灵芝菌丝体生长，并促进灵芝酸的生物合成。已有一些成果表明，培养基优化能够促进灵芝菌丝生长，并增加灵芝酸产量。在培养基中添加2%薏苡仁油，菌丝体生物量、灵芝酸产量分别可达对照的2.44和4.04倍[10]。江丹丹等[11]研究发现，在灵芝栽培培养基中加入1%黑豆粉时，灵芝子实体壳聚糖得率比对照组提高了43%。

研究结果表明，相同浓度的野生黑豆比栽培黑豆对灵芝酸生物合成的诱导作用更显著(图3、图6)。可能的原因是野生黑豆成长过程的生存环境较栽培黑豆经历的恶劣的逆境，在抗逆过程中野生黑豆积累的大豆异黄酮、花青素等生物活性因子比栽培黑豆更多。周三等[7]研究发现，野生黑豆和栽培黑豆之的间蛋白质含量无显著差异，但野生黑豆中的大豆异黄酮含量显著高于栽培黑豆。这些生物活性因子可能对灵芝酸生物合成途径相关酶类的基因转录或酶蛋白活性有促进作用[12]，其具体的诱导机制有待进一步研究。