蛛网膜下腔出血后脑心综合征大鼠体内肾素—血管紧张素的变化

潘瑞 杜业亮 牟伟男

[摘要] 目的 探讨蛛网膜下腔出血（SAH）并发脑心综合征（CCS）大鼠肾素-血管紧张素的变化。 方法 枕大池注入自体动脉血法复制SAH模型，健康雄性Wistar大鼠75只，6周龄，体重150～200 g，所有大鼠均与动力实验室系统连接（Power Lab系统）检测心电图，排除异常心电图者。将动物随機分为手术组（50只）、假手术组（25只）。手术组根据术后心电图不同分为SAH组、CCS组，每组各25只（不足者同条件新鼠补入），各组大鼠按取材时段不同随机分为1、3、5、7、14 d等5个亚组，每组5只。造模后用Power Lab系统检测心电图，分别于1、3、5、7、14 d再次检测心电图，用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血浆中肾素活性（PRA）及血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的含量。 结果 造模成功后，假手术组心电图未见明显变化，手术组术后2 h CCS病发率最高。1 d时SAH组、CCS组PRA、AngⅡ含量均高于假手术组（P < 0.05），且CCS组高于SAH组（P < 0.05）；SAH组和CCS组PRA、AngⅡ在3 d时达到高峰，显著高于假手术组（P < 0.05），而CCS组高于SAH组（P < 0.05）；5、7 d时SAH组、CCS组PRA、AngⅡ含量逐渐下降，仍高于假手术组（P < 0.05）。假手术组PRA、AngⅡ含量随时间延长逐渐下降至7 d后趋于稳定；SAH组及CCS组PRA、AngⅡ含量3 d达高峰，后逐渐下降至14 d基本趋于假手术组水平（P > 0.05）。 结论 SAH并发CCS的PRA、AngⅡ呈逐渐上升达高峰后逐渐下降趋于稳定的变化，提示PRA、AngⅡ在SAH并发CCS的发生与发展中起到了一定的作用。

[关键词] 脑心综合征；蛛网膜下腔出血；肾素活性；血管紧张素Ⅱ

[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）08（c）-0018-04

[Abstract] Objective To investigate the changes of renin-angiotensin in rats with subarachnoid hemorrhage （SAH） complicated by cerebral-cardiac syndrome （CCS）. Methods The occipital large pool was injected with autologous arterial blood to replicate the SAH model. Seventy-five healthy male Wistar rats were 6 weeks old and weighed 150-200 g. All rats were connected to a dynamic laboratory system （Power Lab system） to detect ECG， excluding abnormal ECG. The rats were randomly divided into surgery group （50 rats） and sham group （25 rats）. The surgical group was divided into SAH group and CCS group according to different electrocardiograms after surgery. Each group had 25 animals （insufficient ones were recruited in the same condition as new rat）. Different time periods were randomly divided into five subgroups： 1， 3， 5， 7， 14 d group， with 5 rats in each group. Electrocardiograms were measured with the Power Lab system after modeling， and electrocardiograms were again detected on day 1， 3， 5， 7 and 14. The levels of plasma renin activity （PRA） and angiotensin Ⅱ （AngⅡ） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results After successful modeling， there was no significant change in electrocardiogram in the sham-operated group. The incidence of cerebral-cardiac syndrome was highest in the surgical group at 2 hours after surgery. The levels of PRA and AngⅡ in SAH group and CCS group were higher than those in sham-operated group at day 1 （P < 0.05）， and the CCS group was higher than the SAH group （P < 0.05）； PRA and AngⅡ peaked at 3 days in SAH group and CCS group were significantly higher than that in sham operation group （P < 0.05）， and CCS group was higher than the SAH group （P < 0.05）. The contents of PRA and AngⅡ in SAH group and CCS group decreased gradually after 5 and 7 days， which was still higher than that in sham operation group （P < 0.05）. The contents of PRA and AngⅡ gradually decreased to 7 days and then stabilized in the sham operation group. The levels of PRA and AngⅡ in the SAH group and the CCS group reached the peak at 3 days， and then gradually decreased to 14 days afterwards， and the levels of PRA and AngⅡ basically reached the level of the sham operation group （P > 0.05）. Conclusion PRA and AngⅡ in SAH complicated with CCS gradually increase and reach a peak， then gradually decrease and tend to be stable. This suggests that PRA and AngⅡ play a certain role in the occurrence and development of SAH concurrent with CCS.

[Key words] Cerebral-cardiac syndrome； Subarachnoid hemorrhage； Plasma renin activity； Angiotensin Ⅱ

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一種发病率高的致死性疾病[1]，是一种较为常见和严重的脑出血性疾病，人群每年的发病率为6/10万～10/10万，占脑卒中的3%～5%[2]，主要指由多种因素所致脑表面或底部血管破裂，血液进入蛛网膜下腔，从而并发的以剧烈头痛、肢体瘫痪、甚至昏迷为主要临床表现的一种综合征[3]。脑心综合征（cerebral-cardiac syndrome，CCS）又称为脑源性心脏损害，指各种脑部病变所致的继发性心脏损害，主要表现为心电图复极改变、心律失常、血浆心肌酶活性升高、心力衰竭等，严重者可发生猝死[4]。目前，CCS的发病机制尚不明确，本研究通过大鼠枕大池注入自体动脉血法建立SAH致CCS模型，检测大鼠血浆中肾素活性（PRA）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的动态变化，为进一步探讨SAH并发CCS的发病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠75只，6周龄，体重150～200 g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司供应（许可证号：SCXK[鲁]20140007）。

1.1.2 实验仪器 大鼠脑立体定位仪（上海医疗仪器厂），1 mL注射器。

1.1.3 实验试剂 大鼠PRA酶联免疫分析试剂盒（96T，批号E-30960）、大鼠AngⅡ酶联免疫分析试剂盒（96T，批号E-31022）（上海一研生物科技有限公司）。

1.2 实验分组

所有大鼠均与动力实验室系统连接（Power Lab系统）检测心电图，排除异常心电图者，将其随机分为手术组（50只）、假手术组（25只）。手术组根据术后心电图不同分为SAH组、CCS组，每组各25只（不足者同条件新鼠补入），各组大鼠按取材时段不同随机分为1、3、5、7、14 d等5个亚组，每组5只。

1.3 模型制备

采用自体股动脉血枕大池单次注血法复制SAH模型。手术组大鼠：常规消毒手术器械；按体重0.35 mL/100 g用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉；连接Power Lab系统测心电图正常后，备皮、固定、消毒，切开皮肤，分离出股动脉供放血用。后俯卧于立体定向仪上，备皮、消毒，以寰枕交界部为中心，纵向切开暴露枕骨下缘、寰椎和寰枕膜。1 mL注射器针头刺破寰枕膜中点，连接注射器，进入小脑延髓池，回抽见有脑脊液后固定针头，20 s内注入0.2 mL自体股动脉血，胶海绵修补，大鼠急性颅内压维持，切口缝合，头部维持30 min。术后动态检测Ⅱ导联心电图6 h，选择心电图异常（ST段压低、T波改变、出现U波、心律失常等）大鼠入CCS组，正常心电图者入SAH组，假手术组未分离股动脉，注入等量生理盐水，给予各组大鼠充足食物及水喂养，于48 h后再次重复注血。于造模结束后各组取1只大鼠麻醉后灌注处死，获取脑部标本，其中造模成功的标准为见到枕骨大池、基底池、小脑、大脑、脑干以及大脑表面有血块存在。每组造模后，1、3、5、7、14 d组检测Ⅱ导联心电图2 h，取每组血浆待测。

1.4 样品采集及处理

将大鼠麻醉固定后，穿刺抽取大鼠右心室血2 mL，于低温离心机4℃、3000 r/min、半径10 cm条件下离心20 min，如出现沉淀再次离心，后放置于-80℃冰箱保存待测。准备试剂，加入准备好的样品和标准品，37℃反应30 min，洗板5次，加入酶标试剂，37℃反应30 min，洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色10 min，加入终止液，15 min之内读OD值，计算出样品浓度。

1.5 统计学方法

数据均选用SPSS 17.0统计软件统计分析，所有计量资料均采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用重复测量数据的方差分析，两组间比较采用LSD-t检验；相关性采用Pearson直线相关分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠心电图比较

造模成功后持续检测心电图6 h，1、3、5、7、14 d假手术组心电图未见明显变化；手术组术后已建立的SAH模型中2 h出现心电图异常发病率最高，CCS组25只心电图异常大鼠（其中心律失常12只、ST-T段压低7只、T波改变4只、出现U波2只）。

2.2 三组大鼠血浆肾素活性含量比较

造模成功后，用LSD-t检验对1、3、5、7 d时刻血浆中的PRA情况进行后续的多重比较，结果如下：1 d时SAH组、CCS组PRA含量均高于假手术组（P < 0.05），且CCS组高于SAH组（P < 0.05）；3 d时SAH组、CCS组PRA含量达高峰，均显著高于假手术组（P < 0.05），且CCS组高于SAH组（P < 0.05）；5、7 d时SAH组、CCS组PRA含量逐渐下降，仍高于假手术组（P < 0.05）。随时间延长假手术组PRA含量逐渐下降，7 d后趋于稳定，SAH组及CCS组PRA含量3 d达高峰，然后逐渐下降，14 d后基本趋于假手术组水平（P > 0.05）。见表1。

2.3 三组大鼠血浆血管紧张素Ⅱ含量比较

造模成功后，用LSD-t检验对1、3、5、7 d时刻血浆中的AngⅡ情况进行后续的多重比较，结果如下：1 d时SAH组、CCS组AngⅡ含量均高于假手术组（P < 0.05），且CCS组高于SAH组（P < 0.05）；3 d时SAH组、CCS组AngⅡ含量达高峰，均显著高于假手术组（P < 0.05），且CCS组高于SAH组（P < 0.05）；5、7 d时SAH组、CCS组AngⅡ含量逐渐下降，仍高于假手术组（P < 0.05）；假手术组AngⅡ含量随时间延长逐渐下降，至7 d后趋于稳定；SAH组及CCS组AngⅡ含量3 d达高峰，后逐渐下降至14 d基本趋于假手术组水平（P > 0.05）。见表2。

2.4 三组大鼠血浆PRA与AngⅡ含量的相关分析

Pearson线性相关分析结果显示，血浆PRA含量与AngⅡ含量呈正相关（r = 0.854，P < 0.01）。

3 讨论

急性脑血管病引起CCS的发病率为62%～90%[5]，其核心特点是心脏运动异常的区域与冠状动脉供血区域不一致[6-10]，其病理生理及分子机制尚未阐明。目前，大多数研究表明，CCS与植物神经功能的异常改变和脑部病变引起的体液改变相关。

肾素-血管紧张素系统（RAS）或肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）在维持机体内水、电解质及血压平衡过程中具有重要作用，并具有调节大脑生理和病理性的作用[11]，其中血管紧张素转化酶可促进肾素转化为AngⅡ后进一步与其受体结合[12]，有研究指出，其与脑血管事件发生、发展关系密切[13]。近年来，研究发现脑内存在单独的RAS，与循环系统的RAS协同参与脑组织结构与功能的调节[14]。AngⅡ是RAS系统的主要效应物质，它也被称为最强的内源性缩血管因子，能直接促进醛固酮的分泌，进一步促进肾小管上皮细胞对水的通透性，增加水的重吸收，加重脑水肿。已有研究表明[15]，在大鼠颅脑损伤模型中AngⅡ水平显著升高。

SAH至颅内压升高，机体产生应激反应[16]，血浆中AngⅡ含量升高，引起冠状动脉收缩，增加心肌灌注阻力，减少心肌血液供应，诱发急性心肌缺血性损伤[17-19]，经磷酸肌醇激酶和AngⅡ受体调节细胞内钙浓度和交感神经相互作用，导致心肌过度收缩，引起心肌缺血和缺氧，高浓度的AngⅡ可提升醛固酮、精氨酸加压素等，增加心脏前负荷，而心律失常为最常见的症状，不同类型心律失常发生率不同，最常见的是QT间期延长[20-22]，这可能与CCS的发生及发展有一定的关联。

本研究观察了SAH后持续6 h心律失常的发生情况，以及14 d中血浆PRA、AngⅡ含量的变化。结果显示，PRA、AngⅡ含量在SAH及SAH并发CCS组中均明显升高，且3 d达最高，后含量逐渐下降并趋于稳定。相比单纯SAH组，SAH并发CCS组血浆及心肌局部组织中PRA、AngⅡ含量升高幅度更加明显，随着CCS组出现心律失常及其逐渐恢复，血浆中的PRA、AngⅡ含量亦达高峰后迅速下降，说明RAS系统在CCS的发生发展中起着重要作用。实验中发现CCS在SAH 2 h發生率最高，这与文献中AngⅡ增高直接或间接刺激交感神经而增强对冠脉和心肌的收缩作用，使心脏做功加强但心肌供血却相对不足，心肌氧耗量增加而氧供减少，以致能量耗竭，呼吸链功能紊乱[23]，从而加重心肌损伤一致。另有报道称AngⅡ还通过激活交感神经系统使去甲肾上腺素释放增多，进一步加重心脏的负荷；收缩冠脉使冠脉循环障碍，内皮细胞收损，内皮依赖性舒张减弱，促使自由基产生。

综上所述，SAH早期RAS系统被激活，血浆中PRA、AngⅡ含量迅速上升，经过急性期后，心律失常逐渐恢复，血浆中PRA、AngⅡ含量亦逐渐下降趋于正常，提示PRA、AngⅡ在SAH并发CCS的发生与发展中起到了一定的作用。由于实验组试验次数较少，所有CCS病例均无心肌梗死及其他严重心肌组织损伤，在未来的实验中需要进一步扩大样本量深入研究。

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（收稿日期：2018-03-27 本文编辑：张瑜杰）