羟基磷灰石碳纳米管对骨髓间充质干细胞的毒性作用及多向分化的影响

宋国栋 郭小双 宗宪磊

[摘要] 目的 制备羟基磷灰石修饰的多壁碳纳米管（HA-MWCNTs），探索HA-MWCNTs对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的毒性作用及其多向分化能力的影响，为HA-MWCNTs在组织工程中的应用提供试验依据。 方法 制备HA-MWCNTs，通过透视电镜、X线衍射分析其微观形态；取体重100～150 g的4周龄雌性SD大鼠骨髓间充质干细胞，利用体外细胞培养技术，将第3代BMSCs与HA-MWCNTs或未修饰的多壁碳纳米管（MWCNTs）共培养，通过MTT法及活死细胞检测评估碳纳米管对BMSCs的细胞毒性；通过诱导其脂向及骨向分化，评估碳纳米管对BMSCs多向分化能力的影响。 结果 与对照组比较，Raw-MWCNTs对细胞增殖有明显抑制作用（P < 0.05），而HA-MWCNTs对细胞增殖活力影响较小（P > 0.05）；活死细胞检测提示HA-MWCNTs组死细胞率较低。HA-MWCNTs使 BMSCs骨向分化相关基因Cbfal/Runx2、BSP、OCN的信使RNA升高（P < 0.05），脂向分化相关基因aP2、脂蛋白脂酶的信使RNA降低（P < 0.05）。 结论 与MWCNTs比较，HA-MWCNTs对细胞的增殖影响较小，细胞毒性较低，生物相容性良好。HA-MWCNTs可促进BMSCs骨向分化，抑制其脂向分化。其在骨组织工程领域中的应用具有良好前景。

[关键词] 羟基磷灰石；碳纳米管；骨髓间充質干细胞；多向分化

[中图分类号] R318.08 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）08（c）-0004-06

[Abstract] Objective To develop hydroxyapatite functionalized multi-walled carbon nanotubes （HA-MWCNTs）， and assess the toxicity of HA-MWCNTs on rat′s BMSCs and its influence on the multipotent differentiation of bone marrow derived mesenchymal stem cells （BMSCs）， thereby to provide experimental evidence for its utility in tissue engineering. Methods HA-MWCNTs were synthesized. Transmission electron microscope （TEM）， X-ray diffraction （XRD） were used to observe the microstructure； BMSCs were obtained from female SD rats of 4 weeks old which weighted between 100 to 150 grams. After cultured and expanded to the third passage， cells were co-cultured with HA-MWCNTs and unfunctionalized MWCNTs （MWCNTs）. MTT and live-dead cell assay were used to appraise the toxicity of MWCNTs on BMSCs. BMSCs were then induced and differentiated into adipocytic and osteoblastic cells and were used to assess the influence of MWCNTs on BMSCs′ multipotent differentiation. Results Compared to control group， BMSCs in MWCNTs group were significantly inhibited （P < 0.05）， while in HA-MWCNTs group， BMSCs were slightly inhibited， with no statistical difference （P > 0.05）， and the ratio of dead cells was less in HA-MWCNTs group. The mRNA level of osteogenesis （Cbfal/Runx2， BSP and OCN） was increased （P < 0.05） and the mRNA of adipogenesis （aP2 and LPL） was decreased （P < 0.05） in HA-MWCNTs group. Conclusion Compared with MWCNTs， HA-MWCNTs had slight influence on cell proliferation， trivial toxicity and favorable biocompatibility of BMSCs， meanwhile it could promote osteoblastic and inhibit adipocytic differentiation of BMSCs. HA-MWCNTs may supply a novel platform for applications of scaffold in bone tissue engineering.

[Key words] Hydroxyapatite； Carbon nanotube； Bone-marrow derived mesenchymal stem cell； Multipotent differentiation

肿瘤、创伤、先天性疾病导致的大范围骨缺损是临床上面临的重大难题。骨缺损修复的方法有自体骨移植、异体骨移植、生物材料移植等方案[1]。自体骨作为骨缺损修复的金标准，具有生物相容性好、力学强度适宜等优点；然而，取材有限和供区的继发畸形极大地限制了其临床应用[2]。异体骨移植具有排异反应和感染疾病的风险，在临床中应用较少[3]。利用具有优良骨传导性的生物材料修复骨缺损，是目前国内外研究的热点。

羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是一种生物相容性较高的生物材料，具有优良的骨传导性[4-5]。大量实验已证实：将HA材料与骨髓间质充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）复合，是修复骨缺损的理想治疗方法[6]。然而，HA韧性低、强度差的特点，限制了其在骨组织领域的应用[4]。为改善上述缺点，有学者将HA与碳纳米管（carbon nanotubes，CNTs）结合应用于骨组织工程研究中，并发现复合材料的强度及骨诱导性大大增强[7]。CNTs是一种具有独特的物理、化学和生物学性能的纳米材料，不仅具有强度高、韧性佳的优点，同时又具有良好的光学、磁学及电学性能[8]。它不仅可以将药物靶向传递至特定组织，而且在红外线照射下，能够产热杀灭病变细胞，为癌症治疗提供契机[9]。然而，在范德华力的作用下，CNTs极易在水或者有机溶剂中聚集成束。大量的实验证明CNTs具有较大的生物毒性，能够对组织和器官造成严重的破坏[10-11]。研究表明，HA-MWCNTs可以避免单一材料的缺点，起到增加复合材料强度及生物相容性的作用[12-14]。然而目前尚缺少HA-MWCNTs对细胞的毒性作用及多向分化潜能的相关研究。

为此，本实验拟探索羟基磷灰石修饰的多壁碳纳米管（hydroxyapatite functionalized multi-walled carbon nanotubes，HA-MWCNTs）对BMSCs的毒性作用及多向分化能力的影响，为HA-MWCNTs在骨组织工程领域的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物

4周龄的雌性SD大鼠6只（100～150 g），许可证号：SYXK（川）2013-119，动物合格证号：01-3001，购自四川大学实验动物中心。动物等级二级，预饲养2周。

1.2 药品与试剂

多壁碳纳米管（MWCNTs）：外径10～20 nm，长度10～20 μm，纯度≥95%（成都有机化学有限公司，中国科学院）；HA（成都科隆化学试剂有限公司）；活死细胞试剂盒、MTT、a-MEM培养基（GIBCO公司，美國）；碱性磷酸酶检测试剂盒（武汉博士德生物试剂有限公司）；油红O（成都宝信生物试剂有限公司）。

1.3 仪器与设备

X线衍射仪（XRD，Rigaku D/MAX2VA荷兰）；透视电镜（H-800，日本）；荧光倒置显微镜（尼康，日本）；ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems company，美国）；水平电泳仪（BL29-DYCP-31DN，中国）。

1.4 实验方法

1.4.1 HA-MWCNTs制备 利用原位化学沉淀法合成HA-MWCNTs。将氧化处理的MWCNTs加入SDS溶液中超声分散2 h；加入到含有Ca（NO3）2·4H2O的生物矿化液中，调节pH值至10，超声分散30 min；按照Ca、P的摩尔比为1.667，配置（NH4）2HPO4溶液，调节pH值至10，在剧烈搅拌下逐滴加入上述混合溶液中；将获得的样品静置陈化2 d；用蒸馏水反复冲洗至滤液pH为7。利用透射电镜检测HA在MWCNTs表面的形成。用XRD测定HA-MWCNTs的各相成分。

1.4.2 细胞分离和培养 4周龄的雌性SD大鼠，断颈处死，70%乙醇消毒30 min，取胫骨和股骨，去除骨上附着的软组织和骨骺端。将分离的股骨和胫骨移入无菌平皿，用针管抽5 mL PBS将骨髓冲出，用200目滤网过滤，1500 r/min 25℃ 离心4 min（离心半径9 cm）。将沉淀的细胞重悬于10 mL培养基中，2×106个细胞接种于90 mm培养皿中。接种后24～48 h换液，7～10 d传代。培养至第三代的BMSCs备用。

1.5 测量指标

1.5.1 MTT 将MWCNTs、HA-MWCNTs溶于a-MEM培养基中，配成10 μg/mL混合培养基。将第三代的BMSCs以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200 μL。放入CO2孵箱，在37℃、5%CO2及饱和湿度下进行培养。分别于1、3、5 d对细胞活力进行评估。每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，37℃孵育4 h，终止培养，弃上清液。每孔加入150 μL二甲基亚枫，震荡10 min后于490 nm波长测吸光度。

1.5.2 活死细胞检测 将BMSCs与MWCNTs、HA-MWCNTs共培养72 h；运用活死细胞试剂盒对细胞进行染色，活细胞呈现绿色荧光，死细胞呈现红色荧光。

1.5.3 BMSCs的成骨和成脂诱导 以5×106的细胞量接种于6孔板；培养基为含或不含30 μg/mL HA-MWCNTs的成骨或者成脂诱导培养基；2周后，行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性检测及染色，茜素红染色，油红O染色，实时定量多聚酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹检测。

1.5.4 RT-PCR 使用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA，将RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板在ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪上进行扩增；成骨向分化的目的基因为核心结合因子（Cbfa1/Runx2）、骨涎蛋白（BSP）和骨钙素（OCN），成脂向分化的目的基因为过氧化物酶体增生物激活受体γ2（PPARγ2）、脂肪酸结合蛋白2（aP2/ALBP）和脂蛋白酯酶（LPL），β-actin作为内参。目的基因的引物设计序列见表1。

1.5.5 蛋白质印迹分析 首先利用SDS-PAGE凝胶电泳技术分离提取蛋白质，并将其转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上；将膜置入含3% BSA的0.05% TBS-Tween 20封闭液中（室温，2 h），然后根据试剂盒说明加入适量的一抗（抗Cbfal/Runx2、PPARγ和GAPDH）室温孵育2 h；用0.05% TBS-Tween 20洗涤PVDF膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育2 h；化学发光法显示目的条带，定量分析光密度值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，单因素的方差分析（One-way ANOVA），组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HA-WMCNTs官能团检测

透射电镜显示：HA晶体均匀的缠绕于MWCNTs表面，呈球状，而非短棒状结构，这表明MWCNTs作为结晶中心，为HA在纳米管表面的生长提供支持，见图1。XRD显示：在HA功能化的MWCNTs中，有羟基磷灰石组分的形成。HA组分的特异性峰值主要集中在25.9°、31.8°、39.7°，见图2。

2.2 HA-MWCNTs的细胞毒性

MTT提示，与对照组比较，HA-MWCNTs和MWCNTs能够抑制细胞的增殖，但HA-MWCNTs则对细胞的增殖活力没有大的影响，表现出良好的生物相容性，见图3。活死细胞检测示，活细胞呈现绿色荧光，死细胞呈红色荧光。MWCNTs组的死细胞比率较大，而HA-MWCNTs组死细胞较少，见图4（封底）。

2.3 HA-MWCNTs对BMSCs分化的影响

成骨：与MWCNTs组比较，HA-MWCNTs组的ALP颗粒的阳性分布率较高，ALP活性较高。见图5～6。

成脂：HA-MWCNTs组油红O洗脱液的吸光度在第2周降低了27.9%（P < 0.05），与MWCNTs组比较，HA-MWCNTs组观察到较少的脂滴形成。见图7。

RT-PCR：检测结果用mRNA表达的相对倍数表示，结果显示，成骨或成脂诱导培养2周后，HA-MWCNTs组与MWCNTs组比较，Cbfal/Runx2增加了36%（P < 0.05），BSP增加了74%（P < 0.05），OCN增加了97%（P < 0.05）；而PPARγ2下调了26%（P < 0.05），aP2/ALBP下调了42%（P < 0.05），LPL下调了49%（P < 0.05），提示HA-MWCNTs组成骨相关基因（Cbfal/Runx2、BSP、OCN）的表达增加，成脂相关基因（PPARγ2、aP2/ALBP、LPL）的表达降低。见图8。

蛋白质印迹：成骨或者成脂诱导2周后，与MWCNTs组比较，HA-MWCNTs组细胞中Cbfal/Runx2的蛋白表达水平增加78%（P < 0.05）；而PPARγ的蛋白水平下调31%（P < 0.05）。见图9。

3 讨论

HA是一种具有高度生物活性的硬组织植入材料，在骨科领域被广泛应用，但是存在强度低、韧性差的缺点[4]。CNTs具强度高，韧性好，并且具有优异的光、电、磁学性能，在生物力学领域具有较好的前景。将CNTs和HA复合能够增强复合物的生物力学性能，同时提高其生物相容性[6，15]。研究表明，MWCNTs的加入不仅改变了HA的物理形貌，而且也增强了磷酸钙水泥的机械强度，抗压强度达到了16.3 MPa，超过了人体松质骨的强度。目前已有较多研究报道了HA-MWCNTs的制备，及其物理、化学、生物学性能[4，7，15-18]。

Jing等[16]发现胶原/HA/MWCNTs复合物在体内外均表现出优良的骨诱导性及骨传导性。Li等[7]发现HA-MWCNTs复合物具有较强的力学强度及粗糙的微观结构，有利于骨缺损创面中成骨细胞的黏附及生长，促进成骨细胞的活性，从而增强骨再生。此外，Li等[7]的实验报道了碳纳米管不仅能够促进脂肪间充质干细胞的骨向分化，而且在体内能够诱导异位骨的形成。这些实验结果为碳纳米管在组织工程领域的应用提供了实验依据。

本实验研究了HA-MWCNTs对大鼠BMSCs的毒性作用及多向分化的影响。结果表明：羟基磷灰石功能化的碳纳米管溶解性高，细胞毒性较小。已有文献报道：羟基磷灰石能够促进BMSCs的增殖和骨向分化。本实验结果显示：BMSCs在成骨或者成脂诱导2周后，HA-MWCNTs增加了细胞Cbfal/Runx2、BSP、OCN成骨相关因子的表达，而抑制了成脂相关基因PPARγ2、aP2/ALBP的表达。此结果与前期文献报道的细胞的成骨和成脂相关基因是反向调节的结论一致[19-21]。

本实验的缺陷：①只使用一种HA-MWCNTs的浓度（30 μg/mL），尚无法反映HA-MWCNTs与BMSCs增殖、分化的量效关系；②只使用一个时间点（2周），数据尚不足以評估HA-MWCNTs与BMSCs多向分化的时间-效应关系。故而，多剂量、多时间点的实验有待于进一步实施。

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（收稿日期：2018-02-25 本文編辑：任 念）