紫外可见分光光度法测定芪元颗粒提取纯化后总黄酮的含量

李 霞，梁惠珍，门九章，银 霞

（山西中医药大学，山西晋中030619）

芪元颗粒是山西省著名中医临床家门纯德教授治疗过敏性紫癜（Henoch-Schonlein purpura，HSP）的经验方，由黄芪、玄参、当归、金银花、白茅根和甘草六味药物组成，此方益气养阴、凉血解毒，经过多年的临床应用，取得了满意的疗效。本课题的前期实验与临床研究已经明确，芪元颗粒具有良好的防治过敏性紫癜的疗效，其主要的作用机理是提高HSP模型小鼠的网状内皮系统功能，减少其血清循环免疫复合物含量［1］，且能调节HSP患者的细胞免疫功能［2］。本课题在前期工作中已经优选了芪元颗粒中总黄酮的提取和纯化工艺，本实验采用紫外可见分光光度法测定芪元颗粒提取纯化后总黄酮的含量，为后续有效部位的药效学试验提供科学依据。

1 仪器与试药

TU-1810紫外可见分光光度计（北京谱析通用仪器有限责任公司）；FA-2104型电子分析天平（上海精科天平）；HH-2数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；粉碎机（浙江省永康市象珠松青五金厂）；AB135-S型电子分析天平（Made in Switzerland）；SHZD（II）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。

黄芪、玄参、白茅根、当归、金银花、甘草等药材购自山西维康堂中药饮片有限公司；芦丁对照品（含量测定用，批号：100080-201409）购自中国食品药品检定研究院；聚酰胺（60-80目）购自江苏长本化工有限公司；95%乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯；水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 聚酰胺的预处理

将聚酰胺树脂用蒸馏水浸泡24 h，依次用2 BV的2 mol/L的氢氧化钠溶液、2 BV的2 mol/L的盐酸溶液进行洗涤，均以蒸馏水洗至中性；再用95%乙醇洗涤，将乙醇液与水按1∶5比例混合，直至无白色浑浊为止；再用蒸馏水洗至无醇味，备用［3］。

2.2 总黄酮样品的制备

芪元颗粒复方各药材50倍量，加6倍量70%乙醇，经2次回流提取，每次0.5 h，过滤，将滤液合并，减压浓缩滤液至无醇味；再按照最佳纯化条件［4］，将浓缩水液加入已处理好的聚酰胺色谱柱中，以1.0 mL/min的流速进行动态吸附，吸附完全后，用蒸馏水洗涤，直至流出液无色；用90%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至无醇味。再用聚酰胺重复纯化1次，收集洗脱液，合并，回收乙醇，60℃低温干燥，作为总黄酮样品。

2.3 芦丁对照品溶液的制备

取芦丁50 mg，精密称定，放置在25 mL的容量瓶中，加入适量乙醇，通过水浴加热使之溶解，再加入乙醇定容至刻度，摇匀。将精密量取的10 mL溶液放置在100 mL的容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得芦丁对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

精密称量总黄酮样品干膏0.1 g，放置于带塞三角瓶中，加入70%乙醇20 mL，超声提取20 min，滤过，将滤液置于25 mL的容量瓶中，加入70%乙醇定容至刻线，即得供试品溶液。

2.5 最大吸收波长的确定

精密吸取芦丁对照品溶液和供试品溶液各1 mL，放置在25 mL的容量瓶中，按照标准曲线的制备方法进行制备，以相应的试剂为空白对照，在200～700 nm波长范围内扫描。结果显示，芦丁对照品溶液和供试品溶液均在506 nm处有最大吸收，故确定检测波长为506 nm。

2.6 标准曲线的制备

精密量取芦丁对照品溶液 0、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分别放置在25mL的容量瓶中，加入蒸馏水至8 mL，再加入5%的NaNO2溶液1 mL，立即摇匀，室温静置6 min后，加入10%的Al（NO3）3溶液1 mL，摇匀，室温静置6 min后，加入4%的NaOH溶液10 mL，摇匀。分别用蒸馏水稀释并定容至刻度，摇匀，室温放置15 min后，以第一瓶溶液作为空白溶液，在506 nm波长处测定吸光度。以芦丁对照品溶液的浓度为横坐标（X），吸光度值（Y）为纵坐标。得回归方程：Y=9.628 6X+0.035 1，r=0.997。芦丁在0.008～0.048 mg/mL范围内呈良好线性关系。

2.7 精密度试验

精密吸取芦丁对照品溶液3 mL，放置在25 mL的容量瓶中，按标准曲线项2.6操作，在506 nm处测定其吸光度，平行测定吸光度值6次。实验结果显示，精密度RSD为2.96%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验

精密吸取供试品溶液5 mL，放置在25 mL的容量瓶中，按标准曲线项2.6操作，分别在0、30 min、60 min、80 min、100 min、120 min 测定吸光度。实验结果显示，供试品稳定性的RSD为0.51%。表明供试品溶液在120 min内稳定性良好，符合标准。

2.9 重复性试验

精密称量总黄酮样品干膏0.1 g，放置于带塞三角瓶中，共6份。按照供试品溶液的制备项2.4方法进行制备，再精密吸取供试品溶液5 mL，放置在25 mL的容量瓶中，按标准曲线项2.6操作，在506 nm处测定其吸光度，计算总黄酮含量。实验结果显示，样品的总黄酮平均含量为373.16 mg/g。RSD为4.41%。

2.10 加样回收率试验

精密称量总黄酮样品干膏0.05 g，放置于带塞三角瓶中，再精密加入芦丁对照品18 mg，共6份，按照供试品溶液的制备项2.4方法进行制备，再精密吸取供试品溶液5 mL，放置在25 mL的容量瓶中，按标准曲线项2.6操作，在506 nm处测定其吸光度，计算总黄酮的加样回收率。实验结果显示，平均回收率为97.66%，RSD为2.04%。结果见表1。

表1 加样回收率测定结果

2.11 样品测定

分别精密称取3批样品干膏0.1 g，放置于带塞三角瓶中，按照供试品溶液的制备项2.4方法进行制备，再精密吸取供试品溶液5 mL，放置在25 mL的容量瓶中，按标准曲线项2.6操作，在506 nm处测定其吸光度，计算总黄酮含量。结果见表2。

表2 含量测定结果

3 讨论

黄酮类化合物是药用植物的主要有效成分，具有重要的药用价值。芪元颗粒由黄芪、玄参、金银花、当归、白茅根和甘草组成，这些药物中都含有黄酮类化合物。其中，黄芪总黄酮是黄芪的重要活性部位，具有免疫调节、抗损伤等功效［5］；玄参的主要活性成分虽然以环烯醚萜、苯丙素为主，但是黄酮也是其重要的化学成分［6］；研究显示，金银花可以分离出32个黄酮类化学成分［7］，其黄酮类化合物具有明显的抗氧化损伤、清除羟自由基、提高机体免疫力的功效［8］；白茅根含有三萜类、木脂素类、糖类等多种化学成分，2009年，埃及学者首次从白茅根中分离得到黄酮类化合物，表明黄酮类化合物也是其主要成分［9］；黄酮类化合物是当归的重要活性物质，实验表明，当归总黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌有一定的抑制作用，具有抗菌、抗炎、抗氧化等功效［10］；甘草中含有300多种黄酮类化合物，甘草黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、清除自由基、抗炎、抗心律失常、降脂、保肝、抗衰老、解痉、镇痛等多重功效［11］。因此，黄酮类化合物作为芪元颗粒的主要有效成分，在治疗过敏性紫癜时发挥着重要的作用。

本课题在前期工作中已经优选了芪元颗粒中总黄酮的提取和纯化工艺，本实验是采用紫外可见分光光度法对芪元颗粒提取纯化后总黄酮的含量进行测定。实验中，供试品溶液的制备采用了超声提取法，超声波技术具有很多优点，可以提高有效成分的提取率，避免常规煎煮法对有效成分的影响，尽可能保持有效成分的生理活性。实验结果表明，紫外可见分光光度法简便、快速、灵敏、准确，重复性好，易于推广，可作为芪元颗粒提取纯化后总黄酮的含量测定方法。