嗜盐古菌Halorussus sp. XZYJ18产胞外蛋白酶特点及其酶学性质

侯靖，徐佳琪，崔恒林

(江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013)

蛋白酶是一类非常重要的水解酶，目前在全球酶制剂市场占到46%的份额，广泛应用于食品、洗涤、医药、皮革等领域[1]。在调味品如酱油、食醋、腐乳生产中，添加蛋白酶有利于蛋白质降解，既可提高原料利用率，缩短发酵周期，降低生产成本，又可改进产品质量和风味。目前商业化的蛋白酶在高盐等极端环境中不能有效地发挥作用，限制了在高盐调味品生产中的应用。

嗜盐古菌通常生活在高盐环境如盐湖、盐场、盐矿和腌制品中。研究表明，嗜盐古菌胞外蛋白酶可以应用于一些极端环境，如有机溶剂中多肽合成[2]、缩短高盐调味品鱼露发酵周期等[3]，从而填补了蛋白酶的应用空白[4]。然而，目前报道的嗜盐古菌胞外蛋白酶通常依赖高盐环境维持活性和稳定性[5-11]，低盐条件不可逆变性失活，从而增加了纯化难度以及限制了应用范围。从自然环境中筛选耐盐、稳定性强的嗜盐古菌胞外蛋白酶成为近年来国内外学者的研究热点[12，13]。我国高盐环境丰富多样，为嗜盐古菌蛋白酶资源的研究提供了很好的材料。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

从西藏芒康盐井古盐田分离的133株嗜盐古菌。

PCR扩增试剂盒、酪蛋白、脱脂奶粉：购自上海生工生物技术服务有限公司。NHM培养基、HM培养基、CM培养基按文献[14]配制。pH 6.0缓冲液为50 mmol/L磷酸-氢氧化钠缓冲液；pH 7.0，8.0，9.0缓冲液均为50 mmol/L Tris-HCl缓冲液；pH 10.0，11.0缓冲液均为50 mmol/L硼砂-氢氧化钠缓冲液。

1.2 主要仪器设备

电子天平 上海精科天平仪器厂；pHS-3TC型酸度计 上海天达仪器有限公司；HBA-1151 PCR仪 MJ Research公司；Avanti J-14离心机 Beckman公司； DU800核酸蛋白分析仪 Beckan-Coulter公司。

1.3 实验方法

1.3.1 产胞外蛋白酶能力的初步评价

取5 μL菌液接种含5 g/L脱脂奶粉的NHM平板，37 ℃培养，通过观察菌苔周围的牛乳蛋白水解圈，筛选产胞外蛋白酶菌株。根据牛乳蛋白水解圈直径与菌苔直径之比初步评价牛乳蛋白水解能力。类似地，将菌液接种含5 g/L明胶的NHM平板，将Frazier试剂(HgCl215 g；浓HCl 20 mL；无菌水100 mL)滴加于菌苔周围检测明胶水解圈。根据明胶水解圈直径与菌苔直径之比初步评价明胶水解能力。

1.3.2 培养基对产胞外蛋白酶能力的影响

取5 μL经NHM，HM和CM培养基活化后的菌液分别接种含5 g/L脱脂奶粉或明胶的NHM，HM和CM平板，于37 ℃培养7天，肉眼观察牛乳蛋白水解圈，用Frazier试剂检测明胶水解圈。

1.3.3 16S rRNA基因序列分析

以水裂解法提取嗜盐古菌基因组作为PCR模板。PCR扩增引物为0018F和1518R[15]。PCR产物由北京诺赛基因组研究中心测序。NCBI BLAST用于基因序列分析。

1.3.4 细胞计数

经NHM培养基活化后的2 mL XZYJ18菌液接种到100 mL NHM培养基中，37 ℃，160 r/min培养，每隔一段时间进行细胞计数。取0.5 mL菌液置于4.5 mL NHM培养基中，充分混匀，此时稀释度为10-1，依次稀释至10-7；10-6和10-7稀释度样品分别取0.5 mL均匀平铺NHM平板(3个平行)，37 ℃培养7天。取菌落数在25～250之间的平板计数。细胞数目(cfu/mL)=菌落数×稀释倍数×2。采用类似的方法测定NHMY培养基(NHM培养基添加5 g/L酵母提取物)中的细胞数目。

1.3.5 蛋白酶活力的测定

经NHM或NHMY培养基活化后的4 mL XZYJ18菌液接种到200 mL NHM或NHMY培养基中，培养至稳定期。培养液离心去除细胞，上清经超滤离心管(10 kDa，Millipore)浓缩10倍后，再用一定pH、NaCl浓度的缓冲液将酶液稀释10倍用于调节酶液的pH、NaCl浓度，即得胞外蛋白酶粗酶液。参照文献[14]，根据福林酚法测定蛋白酶活力。

1.3.6 酶学性质研究

1.3.6.1 温度对蛋白酶活性的影响

按1.3.5所述方法于2 mol/L NaCl、pH 7.0的条件下测定35，40，45，50，55，60，65，70 ℃下的酶活力，探究XZYJ18胞外蛋白酶的最适反应温度。

1.3.6.2 pH对蛋白酶活性的影响

按1.3.5所述方法在2 mol/L NaCl、最适温度下测定pH 6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0下的酶活力，探究XZYJ18胞外蛋白酶的最适反应pH。

酶液于2 mol/L NaCl、pH 6.0，8.0，10.0的条件下于30 ℃放置0，20，40，60 min后，按1.3.5所述方法于2 mol/L NaCl、最适pH、最适温度下测定酶活力，探究XZYJ18胞外蛋白酶的酸碱稳定性。

1.3.6.3 NaCl浓度对蛋白酶活性的影响

按1.3.5所述方法在最适温度、最适pH下测定0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mol/L NaCl下的酶活力，探究XZYJ18胞外蛋白酶的最适反应NaCl浓度。

酶液于最适pH、0，1.0，2.0，3.0 mol/L NaCl的条件下于30 ℃放置0，20，40，60 min，按1.3.5所述方法在1.5 mol/L NaCl、最适温度、最适pH下测定酶活力，探究XZYJ18胞外蛋白酶的NaCl浓度稳定性。

1.4 数据分析

实验数据测定3次，采用SPSS 18.0进行单因素方差分析和事后检验(Turkey法)，显著水平设为0.05。

2 实验结果与讨论

2.1 产胞外蛋白酶菌株的筛选

由于嗜盐古菌遗传操作和生物化学技术建立得相对较晚，相对于丰富的高盐环境和嗜盐古菌资源，嗜盐古菌胞外蛋白酶的研究相对较少。我国西藏芒康盐井古盐田历史悠久，仍然保持着原始手工晒盐方式。课题组前期研究了芒康盐井古盐田中可培养嗜盐古菌的多样性，本研究拟从分离的嗜盐古菌中筛选高产胞外蛋白酶菌株。脱脂奶粉中含有大量的蛋白质，其中2种主要的蛋白质是酪蛋白和乳清蛋白，可采用脱脂奶粉平板验证产胞外蛋白酶能力。

表1 产胞外蛋白酶菌株筛选结果Table 1 The screening results of extracellular protease producing strains

续 表

由表1可知，用NHM-脱脂奶粉平板筛选从西藏芒康盐井古盐田分离的133株嗜盐古菌，共获得11株产胞外蛋白酶菌株，分别为XZYJ18，XZYJ21，XZYJ25，XZYJT10，XZYJT24，XZYJT35，XZYJT36，XZYJT51，XZYJT58，XZYJT63和XZYJT71。16S rRNA基因序列分析表明XZYJ18，XZYJ21，XZYJ25，XZYJT10，XZYJT24，XZYJT36，XZYJT51，XZYJT58，XZYJT63和XZYJT71的最相近菌株为Halorussusrarus，16S rRNA基因序列的相似性为94%～96%；XZYJT35的最相近菌株为Halomicrobiumzhouii，16S rRNA基因序列的相似性为91%。16S rRNA基因序列相似性小于98.65%通常认为属于不同的种[16]，相似性小于95%认为属于不同的属[17]。因此，这11株嗜盐古菌可能为新的分类单元，可能存在新型胞外蛋白酶资源。

通过牛乳蛋白和明胶水解圈直径与菌苔直径之比初步探究胞外蛋白酶酶活。结果表明，除了XZYJT35外，其他10株菌牛乳蛋白水解圈直径与菌苔直径比值均大于或等于2，明胶水解圈直径与菌苔直径比值均大于3，其中XZYJ18的比值最大，分别为5.2和9.6，表明XZYJ18的胞外蛋白酶具有较强的牛乳蛋白和明胶水解能力。用NHM培养基对这11株菌进行摇瓶发酵制备酶液，测定35 ℃、2 mol/L NaCl、pH 7.0条件下的酶活，XZYJ18酶活最高(p<0.05)，为9.6 U/mL，其他均低于或等于8.0 U/mL。总的来说，平板上水解圈直径大小和摇瓶发酵蛋白酶活力的高低大致一致。XZYJ18用于后续蛋白酶合成条件和酶学性质研究。XZYJ18为Halorussus属的新种，这是首次报道Halorussus属具有产胞外蛋白酶能力，对高盐环境中胞外蛋白酶资源的研究有利于丰富产蛋白酶嗜盐古菌物种的种属分布。

2.2 营养条件对XZYJ18蛋白酶合成的影响

图1 XZYJ18在NHM-脱脂奶粉(a)、HM-脱脂奶粉(b)、CM-脱脂奶粉(c)、NHM-明胶(d)、HM-明胶(e)、CM-明胶(f)平板上培养7天的水解圈Fig.1 The hydrolysis zones of XZYJ18 cultured on NHM-milk (a), HM-milk (b), CM-milk (c), NHM-gelatin (d), HM-gelatin (e), and CM-gelatin (f) agar plates for 7 days

将XZYJ18菌株分别接种于常用的嗜盐古菌培养基，即营养贫瘠的NHM、营养适中的HM、营养丰富的CM-脱脂奶粉或明胶平板，通过蛋白水解圈表征胞外蛋白酶酶活以探究适宜的产蛋白酶培养基。由图1可知，不管是以脱脂奶粉还是明胶作为蛋白酶的水解底物，NHM平板上水解圈均最大，HM平板上水解圈次之，CM平板上未产生明显水解圈。这可能是由于XZYJ18菌株在NHM培养基上生长最好，在HM培养基上生长次之，在CM培养基上培养7天几乎没有生长。随后，通过在NHM培养基中添加5 g/L酵母提取物(NHMY)探究营养条件对XZYJ18生长及胞外蛋白酶合成的影响。

表2 XZYJ18在不同培养基中的胞外蛋白酶活性Table 2 Extracellular protease activities of XZYJ18 cultured in different media

由表2可知，与NHM培养基相比，在NHMY培养基中，XZYJ18生长达稳定期时细胞数目增加了3.6倍，但酶活仅增加了60%，表明酵母提取物的添加导致单个细胞的酶活降低，约降低了64%，暗示了营养丰富的培养基可能会抑制蛋白酶合成。D' Alessandro等人发现嗜盐古菌Natrialbamagadii营养受限时能够大量积累胞外蛋白酶[18]，推测胞内能量匮乏诱导了胞外蛋白酶的合成，从而降解蛋白质大分子用于提供细胞生长所需的能量。另外，XZYJ18在NHM培养基中培养72 h达到稳定期，然而，在NHMY培养基中，需要168 h才能达到稳定期。因此，在后续实验中，采用NHM培养基培养XZYJ18菌株合成胞外蛋白酶。

2.3 生长时期依赖的胞外蛋白酶合成

图2 XZYJ18产胞外蛋白酶与细胞生长的关系Fig.2 The relationship between extracellular protease production and cell growth of XZYJ18

由图2可知，XZYJ18在对数生长后期开始大量合成胞外蛋白酶，当菌体生长达稳定期后，酶活最高并趋于稳定，推测培养基中营养物质的耗尽或者群感效应信号分子诱导了胞外蛋白酶的产生。同样地，嗜盐古菌Natrialbamagadii也是在对数期向稳定期过渡时大量产生胞外蛋白酶，认为稳定期培养液中存在某种疏水的分子能够诱导胞外蛋白酶合成[19]。然而，石万良等人研究的嗜盐古菌Natrinemasp. R6-5胞外蛋白酶合成与生长几乎同步[20]，这说明嗜盐古菌中存在不同的蛋白酶合成调控机制。对嗜盐古菌蛋白酶合成条件的研究能够为发酵条件的优化提供指导，从而有利于其大规模生产用于基础研究或工业应用。

2.4 XZYJ18胞外蛋白酶酶学性质

2.4.1 温度对蛋白酶活性的影响

取培养至稳定期的培养液用于酶液制备及酶学性质研究。

图3 温度对XZYJ18胞外蛋白酶酶活的影响Fig.3 Effect of temperature on extracellular protease activities of XZYJ18

由图3可知，在35～70 ℃内，XZYJ18胞外蛋白酶活性随着温度升高先升高后降低，55 ℃时酶活最高(p<0.05)，在45～60 ℃内，酶活为最高酶活的80%以上。因此，与已报道的大部分嗜盐古菌胞外蛋白酶一样，XZYJ18的胞外蛋白酶具有一定的耐热性。食品发酵通常要求在一定的温度维持一段时间，因此，蛋白酶的耐热性对于在食品工业中的应用非常重要。

2.4.2 pH对蛋白酶活性的影响

图4 pH对XZYJ18胞外蛋白酶酶活的影响Fig.4 Effect of pH on extracellular protease activities of XZYJ18

由图4可知，在pH 6.0～11.0内，XZYJ18胞外蛋白酶活性随着pH升高先升高后降低，pH 8.0时酶活最高(p<0.05)，pH 7.0时酶活为最高酶活的81%，pH 9.0时酶活为最高酶活的76%。因此，XZYJ18胞外蛋白酶在中性和弱碱性条件下酶活较高。

图5 XZYJ18胞外蛋白酶的酸碱稳定性Fig.5 Stability of extracellular protease activities of XZYJ18 at different pH values

由图5可知，XZYJ18胞外蛋白酶在pH 6，8，10的条件下放置20，40，60 min酶活均没有显著变化(p>0.05)，表明其具有良好的酸碱稳定性，因而在酸性或碱性条件下均能催化蛋白质水解，可应用于不同的食品工业。

2.4.3 NaCl浓度对蛋白酶活性的影响

嗜盐古菌为高盐环境中的主要微生物类群，严格依赖于高浓度的NaCl生长。嗜盐古菌通过胞内积累高浓度的K+来维持细胞内外渗透压的平衡。高盐环境中的嗜盐古菌蛋白质进化出了一系列独特的特征与机制[21]，赋予了嗜盐古菌酶类良好的耐盐性。

图6 NaCl浓度对XZYJ18胞外蛋白酶酶活的影响Fig.6 Effect of NaCl concentration on extracellular protease activities of XZYJ18

由图6可知，当NaCl浓度为0～1.5 mol/L时，XZYJ18胞外蛋白酶活性随着盐浓度增加逐渐降低。当NaCl浓度为1.5～3.0 mol/L时，XZYJ18胞外蛋白酶活性没有明显变化(p>0.05)，约为最高酶活的62%。因此，虽然XZYJ18菌株分离于高盐环境，其胞外蛋白酶却在无盐条件下展示最高酶活，但在高NaCl浓度下也能保持较高酶活。

图7 XZYJ18胞外蛋白酶的盐度稳定性Fig.7 Stability of extracellular protease activities of XZYJ18 at different NaCl concentration

由图7可知，XZYJ18胞外蛋白酶在0，1，2，3 mol/L NaCl下放置20，40，60 min，酶活均没有明显变化(p>0.05)。目前报道的大部分嗜盐古菌胞外蛋白酶依赖于高盐环境高效发挥作用，如HalogeometricumborinquenseTSS101的胞外蛋白酶最适反应NaCl浓度为20%，在没有NaCl的条件下完全失活[22]；Natrinemasp. R6-5的胞外蛋白酶在3 mol/L NaCl的条件下酶活最高，在0.5 mol/L NaCl的条件下酶活为最高酶活的40%。因此，不同于很多高盐依赖的嗜盐古菌蛋白酶，XZYJ18胞外蛋白酶在高、低NaCl浓度下均具有较高活性及稳定性，该特性使得它能够应用于不同盐浓度的环境中，因而在食品工业将具有广泛应用。

3 结论

本研究从分离自我国西藏芒康盐井古盐田的133株嗜盐古菌中筛选出11株产胞外蛋白酶菌株，其中，Halorussussp. XZYJ18胞外蛋白酶酶活最高。XZYJ18在对数生长后期开始大量合成胞外蛋白酶，营养丰富的培养基会抑制蛋白酶的合成。XZYJ18蛋白酶对温度、pH、盐度均有较好的耐受性，因而将在高盐调味品发酵等工业过程中具有广泛的应用潜力。本研究能够为嗜盐古菌蛋白酶的大规模生产以及工业应用提供一定的理论基础。