秋水仙素处理白掌组培苗的效应与多倍体诱导

郑云飞，徐维杰，廖飞雄

（1江西省九江市林业科学研究所 332001；2江西农业大学园林与艺术学院；3华南农业大学林学与风景园林学院/广东省森林植物种质创新与利用重点实验室）

白掌是天南星科（Araceae）白鹤芋属（Spathiphyllum）的一种多年生草本植物，又名白鹤芋、苞叶芋、匙叶芋。白掌丛生、短茎或无茎；叶长圆形或近披针形，有长尖，叶长 20～30cm、宽 6～8cm；基部圆形，叶柄细长，花梗特长，佛焰苞呈叶状，大而显著，高出叶丛，初开时洁白色，后转为微绿色；花期较长，可达5～6周，通常春季或夏季开花[1,2]。由于花形酷似鹤翘首，色泽洁白无瑕，被人们视为“清白之花”[1]，叶宽大，又取名“一帆风顺”寓意事事顺利，平平安安。然而，白掌抗病性较弱，影响其观赏价值。因此，有必要充分开发、利用现有的资源进行遗传改良。通过组织培养与秋水仙素诱导相结合选育植物多倍体技术在国内外被育种学家广泛应用。本试验利用秋水仙素对白掌不同品种进行多倍体诱导，通过流式细胞仪技术加以鉴定。

1 试验材料

1.1 植物材料

Spathiphyllum floribundum、Spathiphyllum‘Coddy color’、Spathiphyllum‘Parrish’、Spathiphyllum‘Bright’组培苗的茎尖。

材料均来自于广东省农业科学院环境园艺研究所观赏植物中心组培室。

1.2 诱导剂

秋水仙素（colchicine），德国 Sinus公司进口,纯度为99.9%。

2 试验方法

2.1 秋水仙素溶液的配置

取1g秋水仙素置于无菌玻璃瓶中，加100mL无菌蒸馏水，搅拌使其充分溶解，配制成浓度为1%的母液，将配置好的母液过滤灭菌后，用无菌蒸馏水稀释配制成所需浓度的秋水仙素溶液，整个过程要求处于无菌条件下，配置好的溶液在4℃下避光保存。

2.2 秋水仙素处理不同品种

选取生长旺盛，体型较一致的Spathiphyllum‘Bright’、Spathiphyllumfloribundum、Spathiphyllum‘Coddy color’、Spathiphyllum‘Parrish’组培苗，切取茎尖0.5cm左右，放入浓度为0.1%的秋水仙素的瓶中，每瓶装有25mL溶液，90r/min旋转培养96h，处理后接种于培养基MS+30g/L蔗糖+7g/L卡拉胶+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L中，暗培养7d，转到培养基MS+6-BA 4mg/L+LNAA 0.2mg，光照培养7d，记录其萌芽数和存活数，继续光照培养20d后，记录其增殖数和存活数。继代3次，继代培养基为MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L，每瓶5个，每处理6瓶，不加秋水仙素为对照重复2次。

2.3 流式细胞仪鉴定

取实验材料叶片，每个处理选取10株，蒸馏水洗净表面培养基并滤纸擦干，放入在冰箱进行预冷后的培养皿里，加入预冷的约裂解液500μL，刀片快速切碎，整个过程，材料须浸没在解离液里，以便更好地游离细胞核,吸取培养皿内的解离液，用260～560目的尼龙网过滤到离心管中，然后置于冰中，孵育5 min，加入PI染色液（约100μL），置于冰上避光染色12min左右，染色后移至上样管，进行上机检测，每个样品收集至少10000个颗粒。

2.4 数据处理

主要运用EXCEL（WPS版）软件和SPSS17.2软件分析和整理。

3 结果与分析

经过方差分析发现不同白掌品种间其萌芽率和增殖率都存在显著性差异（P均为0.02＜0.05），而成活率并未存在显著性差异（P=0.18＞0.05）。从表1中得出Spathiphyllum‘Bright’品种处理组与对照组的萌芽率都最高，分别为59%，77%；其中Spathiphyllum‘Coddy color’和Spathiphyllum‘Bright’2 个品种对照组萌芽率显著高于处理组；Spathiphyllum floribundum与Spathiphyllum‘Parrish’’2品种略高于处理组，这有可能是秋水仙素对这4个品种茎尖的萌芽有抑制作用以及不同品种对秋水仙素的敏感度不同所导致的。不同白掌品种的茎尖经过秋水仙素处理后，其成活率也有差异，其中Spathiphyllum floribundum和Spathiphyllum‘Parrish’2品种经过秋水仙素处理后存活率相对于对照组来说有所降低，Spathiphyllum‘Parrish’’差异尤为显著，存活率仅为53%，秋水仙素对Spathiphyllum‘Bright’和Spathiphyllum‘Coddy color’2 品种无明显作用。不同白掌品种经秋水仙素处理后，茎尖增殖率有所差异，然而，秋水仙素处理对4个品种的增殖率都明显低于对照组。

表1 不同品种经秋水仙素处理后的生长效果

表2 不同品种经秋水仙素处理后的多倍体诱导效果

表2表明，同一秋水仙素浓度处理相同时间，不同品种的诱变率不同,其中Spathiphyllum.‘Bright’品种诱导率最高，达 67%，Spathiphyllum‘Coddy color’最低，为10%；Spathiphyllum floribundum和Spathiphyllum‘Parrish’品种诱变率分别为38%、30%；“Spathiphyllum floribundum”、Spathiphyllum‘Coddy color’、Spathiphyllum‘Bright’、Spathiphyllum‘Parrish’4 个品种分别获得2株、1株、2株、3株纯四倍体植株。

通过流式细胞仪对细胞DNA含量进行测定和分析，结果表明染色体加倍的植株其DNA含量也相应增加了1倍，四倍体植株峰值位置约为二倍体植株2倍；而在2个位置同时各出现1个峰即有2个峰的植株则为嵌合体植株，这表明该植株同时存在二倍体和四倍体2个倍性水品的细胞。然而，不同品种白掌测定时相对荧光强度值的位置有所不同（图1-4），其中Spathiphyllu‘Bright’、Spathiphyllumfloribundum、Spathiphyllum‘Coddy color’、Spathiphyllum‘Parrish’品种作为对照的二倍体植株的相对荧光强度值分别仅在约 0.70、0.85、0.65、0.60位置出现 1个单峰（图 B、C、D、E），四倍体植株分别仅在约 1.40、1.70、1.30、1.30 位置出现单峰（图b、c、d、e）。结果还发现各嵌合体的峰值比例也有所差异，有些植株四倍体的细胞数量多于二倍体细胞（图Bb），而又有部分植株二倍体细胞较多（图Cc），这有可能是因为植株本身细胞所占比例的差异性。

图1 Spathiphyll um.‘Bright’品种二倍体、四倍体、嵌合体植株DNA相对含量分布图

图2 Spathiphyllum floribundum品种二倍体、四倍体植株DNA相对含量分布图

图3 Spathiphyllum‘Coddy color’品种二倍体、四倍体植株DNA相对含量分布图

图4 Spathiphyllum‘Parrish’品种二倍体、四倍体植株DNA相对含量分布图

4 讨论

人工诱导多倍体是育种研究中的一大突破，此技术不仅克服了自然发生多倍体时间漫长，变异频率极低等困难，还大大解决了远缘杂交不孕等诸多瓶颈问题。其在作物育种上具有十分重要的意义，白掌在自然状态下以二倍体或三倍体形式存在，采用传统育种手段培育白掌新品种较费时、费力。目前，白掌的组织培养体系已经较为成熟，大量研究者对白掌离体快繁技术的各个方面进行了详细的研究。朱根发、吴丽君、陈碧华、毛红俊、陈汉鑫、谢云、林加根、王莲辉等对绿巨人、神灯白掌、香水白掌、维克、皇后白掌、娇小白掌、女神白掌的组织培养进行了一系列研究[3-11]，建立了一套完整的白掌离体快繁体系。白掌主要以叶片、叶柄、腋芽、茎尖、肉穗花序、根尖为外植体进行组织培养，并都成功获得了大量的植株[12-17]。以不同白掌品种为材料，用秋水仙素处理进行多倍体诱导，试验结果表明，不同品种间其萌芽率和增殖率都存在极显著性差异，多倍体诱导率也存在差异，这很有可能是因为品种的差异性对秋水仙素溶液处理产生的敏感度有所不同。目前,白掌品种较为单一，抗病性较弱，极大地影响了其观赏价值和经济效益，对于新品种的选育已是势在必行。