白芨水提物对小鼠黑色素瘤B16F10细胞增殖与迁移的影响

令狐浪，李成龙，姚晓东

(遵义医学院 药学院药学实验教学示范中心，贵州 遵义 563099)

恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)简称恶黑，是一种来源于黑色素细胞，且恶性程度极高的肿瘤，转移早，预后差，死亡率高，晚期和有远端转移的患者平均生存期仅有6～10个月[1-2]。黑色素瘤增殖能力较强，微环境血供丰富，易发生侵袭和转移，扩散迅速，转移部位多见于肺部和脑部[3-4]。白细胞介素-2、干扰素α-2b和达卡巴嗪等黑色素瘤辅助治疗药物毒副作用大，价格贵，并且临床治疗效果欠佳。因此，寻求有效的新型治疗药物变得至关重要。在近30年间，已上市的抗肿瘤药物中有62.9%来自天然产物或其衍生物[5]。中药作为我国特色资源宝库，种类繁多，在药物研发中具有独特优势。

白芨是一种珍稀名贵中药材，为兰科植物白芨(Bletillastriata)的干燥块茎，具有收敛止血和消肿生肌的功效[6]，其野生品资源越来越少，主要产于贵州、四川和湖南等地，已被国家列为濒危珍稀保护植物名录[7]。据《本草纲目》记载：白芨别名连及草、白给等，其根白色，连及而生，故曰白芨[8]。“芨”和“及”通用。现代药理研究表明，白芨具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌和促进伤口愈合等作用。近年来，白芨在抗肿瘤方面时有报道[9-11]，但对黑色素瘤的相关研究却鲜见报道。白芨的主要活性物质为大量含有的多糖类成分，本研究对白芨进行水提醇沉提取白芨粗多糖，同时保留有机小分子物质部分，使用小鼠黑色素瘤B16F10细胞对其进行体外抗肿瘤活性研究，以期能为白芨的后续研究和临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药材 白芨购买于遵义市百姓人大药房，经遵义医学院药学院生药学教研室吴发明博士鉴定为兰科植物白芨属白芨的干燥块茎。

1.2 细胞 小鼠黑色素瘤B16F10细胞由四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室馈赠。

1.3 主要试剂 胎牛血清、DMEM/F12细胞培养基、胰蛋白酶和青霉素/链霉素溶液购买于美国Gibco公司；二甲基亚砜购买于美国Sigma公司；PBS缓冲液粉末购买于北京鼎国生物科技有限公司；CCK8试剂购于江苏碧云天生物科技有限公司；ELISA试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；无水乙醇、氯仿和正丁醇等均为国产分析纯试剂。

1.4 主要仪器 二氧化碳培养箱(美国Thermo公司,型号:Heracell 240i)；倒置荧光显微镜(日本Olympus公司,型号:IX73)；酶标仪(美国Molecular Devices公司,型号:Spectra max plus 384)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司,型号:SW-CJ-2FD)；离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司,型号:TD5M)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂,型号：RE-2000A)。

1.5 主要方法

1.5.1 白芨水提物的制备 取白芨药材粉末50 g，蒸馏水加热提取3次后，合并提取液，减压浓缩至粘稠，缓慢加入无水乙醇使体系乙醇终浓度达80%。4 ℃静置过夜，离心，分别收集沉淀和上清液。沉淀减压干燥即得白芨粗多糖，经计算，1 g白芨药材可提取粗多糖0.32 g，多糖提取率为32%。上清液减压浓缩得其他物质部分(主要为有机小分子物质)，4 ℃冰箱储存备用。将白芨多糖和有机小分子物质配制成较大浓度的母液浓度，临用时使用细胞培养液稀释至作用浓度。

1.5.2 CCK8测定细胞存活率 将生长状态良好的B16F10细胞接种于96孔板内，每组设置6个复孔，分为空白对照组和实验组，其中实验组分别给予不同浓度(10、20、40、80、160 μg/mL)的白芨多糖和有机小分子物质。待细胞稳定贴壁后，按分组情况作用48 h，各孔加入CCK8试剂20 μL，37 ℃、5% CO2培养箱中孵育2 h后终止显色，并于450 nm检测波长测定其吸光度值。

1.5.3 CCK8测定细胞生长曲线 将生长状态良好的B16F10细胞，以1 000个细胞/孔接种于96孔培养板中，每组设置6个复孔，根据细胞存活率实验所测得的IC50值，选用20、40、80 μg/mL作为低、中和高浓度。待细胞生长至贴壁后，分别给予不同浓度的白芨水提物进行处理，培养1、2、3、4、5、6、7 d。于每天定时取出培养板，每孔加入20 μL CCK8溶液，37 ℃、5% CO2培养箱继续培养2 h后取出，酶标仪450 nm处测定各孔吸光度值，以各组吸光度值表示细胞增殖能力大小，绘制生长曲线。

1.5.4 显微镜观察细胞形态 将生长状态良好的B16F10细胞接种于6孔板内，每组设置3个复孔，待细胞稳定贴壁后，使用20、40、80 μg/mL浓度的白芨水提物继续培养48 h后，倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.5.5 细胞划痕检测细胞迁移能力 将生长状态良好的B16F10细胞接种到6孔板中，每组设置3个复孔，当细胞以单细胞层铺满约80%～90%左右时，使用200 μL枪头在每孔的中轴线做一划痕。用PBS洗去划落不贴壁的细胞后，在显微镜下拍照，测出0小时划痕线的宽度。分别加入含20、40、80 μg/mL浓度提取物的无血清培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱继续培养48 h后取出，拍照并检测新的划痕宽度，将划痕宽度的差值作为迁移距离进行比较。

1.5.6 ELISA检测迁移相关蛋白的表达情况 收集空白对照组及20、40、80 μg/mL浓度提取物培养处理后的细胞上清液，每组6个复孔，1 500 rpm，离心5 min，按ELISA试剂盒要求测定基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达情况。使用试剂盒中的样品稀释液稀释MMP-2和MMP-9标准品，将稀释后的标准品和各组样品上清液加入酶标板中，加上封板膜，37 ℃反应90 min；吸去板内液体后，加入生物素抗体工作液，37 ℃反应60 min；洗涤缓冲液洗涤3次，加入亲和素-过氧化物酶复合物工作液(ABC)，37 ℃反应30 min；洗涤后加TMB显色液于37 ℃反应20 min，TMB终止液加入后，于450 nm测定吸光度值。

2 结果

2.1 白芨水提物对小鼠黑色素瘤B16F10细胞存活率的影响 使用CCK8法测定白芨水提物在浓度为10、20、40、80、160 μg/mL时，作用B16F10细胞48 h后对其存活力的影响。图1中显示，经不同浓度的水提物作用后，B16F10细胞的存活率基本呈现下降趋势，并呈现浓度效应关系。与对照组相比，多糖浓度为10 μg/mL时，对细胞存活存在微弱的促进作用；当浓度为20 μg/mL时，存活细胞下降至83.50%；随着作用浓度升高，当浓度达到40、80、160 μg/mL时，细胞的存活率分别为40.44%、29.42%和25.60%。此外，白芨水提物中的有机小分子物质部分对B16F10细胞的存活率显示出更好的抑制作用，当作用浓度为160 μg/mL，B16F10细胞的存活率下降至18.57%。经计算，多糖和有机小分子物质作用B16F10细胞48 h的半数抑制浓度(IC50)分别为51.14、40.61 μg/mL。基于此，本研究选用20、40、80 μg/mL作为低、中和高浓度进一步研究白芨水提物对B16F10细胞增殖和迁移的影响。

*：vs对照组，P<0.05。

2.2 白芨水提物对小鼠黑色素瘤B16F10细胞增殖的影响 图2显示，在对照组中，随着培养天数的延长，测得的OD值呈升高趋势，表示其孔中细胞数目在不断增多，细胞生长在持续进行。在经不同浓度的白芨水提物处理后，细胞的生长受到了明显抑制，其测定的OD值呈下降趋势，作用时间越长，生长的细胞数目越少，提示白芨水提物在体外显著抑制了小鼠黑色素瘤B16F10细胞的增殖作用。

A：多糖；B：有机小分子。

2.3 白芨水提物对小鼠黑色素瘤B16F10细胞形态的影响 使用倒置显微镜观察白芨水提物作用B16F10后细胞形态的改变。如图3所示，对照组细胞贴壁状态良好，形态正常，为不规则的梭形，呈现特有的网状结构。随着白芨水提物作用浓度的增大，细胞数目逐渐减少；低浓度的白芨水提物组(20 μg/mL)，大部分细胞为长梭形，仍然呈现树突网状结构。而使用中、高浓度的白芨水提物进行孵育后(40、80 μg/mL)，细胞形态发生明显改变，细胞松散，体积缩小，呈现固缩的圆形结构，且细胞周围变亮，细胞贴壁疏松，并有部分细胞漂浮。

图3 白芨水提物对小鼠黑色素瘤B16F10细胞形态的影响(×100)

2.4 白芨水提物对小鼠黑色素瘤B16F10细胞迁移的影响 细胞划痕法是测定肿瘤细胞运动特性的方法之一，其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后加入药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力。细胞划痕实验结果显示(见图4)，相比对照组，在加入不同浓度的白芨水提物干预后，B16F10细胞迁移减少，并与浓度呈正相关。细胞在划痕损伤0 h未有明显差异，培养48 h后，对照组划痕面内细胞明显增多。而白芨水提物处理后，除低浓度的白芨水提物组(20 μg/mL)有部分细胞发生迁移，中、高浓度的白芨水提物组(40 、80 μg/mL)边缘较整齐，未见明显细胞迁移。ELISA实验结果亦显示，相比对照组，在经白芨水提物处理后，MMP-2和MMP-9的表达均发生下调，在低浓度的白芨水提物组(20 μg/mL)虽有下调，但不具有统计学意义(P>0.05，见表1)，而中、高浓度的白芨水提物组(40、80 μg/mL)与对照组相比，下调具有显著性差异(P<0.05，见表1)。细胞划痕和ELISA结果提示白芨水提物可抑制B16F10细胞的迁移作用。

图4 白芨水提物对小鼠黑色素瘤B16F10细胞迁移的影响(×100)

表1 白芨水提物对小鼠黑色素瘤B16F10细胞迁移相关蛋白表达的影响

3 讨论

中药治疗癌症具有多靶点、毒副作用小等特点，白芨作为我国传统中药，药用历史悠久，药用价值高。Park等[9]从白芨中分离得到2个新的甾体皂苷化合物，并对四种肿瘤细胞A549，SK-OV-3，SK-MEL-2和HCT15均具有细胞毒性。蒋瑞彬等[10]发现白芨须根醇提物能够抑制A549细胞的生长，并可促进细胞凋亡和抑制细胞转移。孙爱静等[11]从白芨中分离得到5个化合物，其中一糖苷类化合物能够诱导A549细胞周期阻滞于G0/G1期。李浩宇等[12]发现白芨多糖对矽肺大鼠机体的抗氧化系统和免疫系统均具有良好的调节作用。多糖作为白芨的主要药效成分，不但能参与细胞生命代谢，在机体免疫调节、损伤修复和抗肿瘤等方面都发挥一定作用[13]。

侵袭和转移是恶性肿瘤细胞的一个重要特征，细胞外基质(ECM)是肿瘤细胞转移的天然屏障。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类重要的蛋白水解酶，可有效降解ECM及基膜，在肿瘤的侵袭转移过程中发挥重要作用[14]。MMP-2和MMP-9是MMPs中降解ECM的重要蛋白水解酶，其表达增加与肿瘤的浸润转移极为相关[15-17]。虽然白芨中多糖含量极高，是其主要药效成分，但白芨中相对含量较低但活性较高的有机小分子组分是否也具有较好的抗肿瘤活性，且目前鲜见有关白芨在抗黑色素瘤方面的研究报道。因此，本研究对白芨进行水提醇沉制备白芨多糖，同时保留有机小分子物质部分，选用小鼠黑色素瘤B16F10细胞，研究其对B16F10细胞增殖与迁移的影响。实验结果显示，白芨水提物中的多糖和有机小分子物质均可抑制B16F10细胞的增殖与迁移作用，并能下调MMP-2和MMP-9的表达，且与浓度呈正相关。此外，白芨多糖与其有机小分子组分是否对肿瘤治疗具有协同效应，以及有机小分子组分中是哪类物质发挥作用，也值得进一步研究与探讨。