虎杖苷对体外培养人翼状胬肉成纤维细胞增殖的影响

万金兰

翼状胬肉为一种常见的眼科疾病，目前主要治疗以手术切除为主或术中联合应用抗增殖药治疗。有研究表明，角膜表面和结膜下翼状胬肉组织残留是手术后复发的主要原因［1］，手术可能为一种刺激因素，当病变组织中的成纤维细胞大量增殖伴发病理表现则在临床复发。虎杖苷（3，4’，5－三羟基二苯乙烯－3－β－单－D－葡萄糖苷）是从蓼科植物虎杖的干燥根茎中提取的有效成分，具有抗氧化、抗炎、免疫调节、改善糖脂代谢、脏器保护以及心血管疾病治疗作用［2］。该研究以人翼状胬肉成纤维细胞为材料，通过检测虎杖苷对人翼状胬肉成纤维细胞（human pterygium fibroblasts，HPF）增殖的影响，旨在为抗复发治疗翼状胬肉提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 虎杖苷（南京青泽医药科技开发有限公司，批号：20141106，纯度≥98%），RPMI1640 培养液、胎牛血清 （Gibco公司），四甲基偶氮唑蓝（MTT），二甲基亚砜（DMSO），PBS 液，胰蛋白酶，EDTA，青霉素，链霉素均来自Sigma公司；小鼠抗人角蛋白及波形蛋白单克隆抗体、小鼠抗人PCNA单克隆抗体和羊抗鼠IgG为武汉博士德公司产品。恒温二氧化碳培养箱，倒置显微镜，DG－3022A型酶联免疫检测仪，流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 方 法

1.2.1 PFB的体外培养、纯化及鉴定 选取自笔者所在医院行翼状胬肉手术中切除的胬肉组织，将组织块接种于直径为6 cm的培养皿中，加入含20%胎牛血清的高糖DMEM完全培养液，在37℃、体积5%CO2细胞培养箱中培养，换液1次/3～4 d。待瓶底长满70%～80%细胞后按1∶3传代。选取第3～4代细胞进行实验。制作细胞玻片，采用SP法染色鉴定细胞。

1.2.2 MTT检测虎杖苷对细胞增殖的影响 按1×104/ml将消化好的第3代成纤维细胞转移到96孔板内，共设4组，每组设复孔4孔，培养24 h，待细胞贴壁后加药。虎杖苷设阴性对照组、10－2mol/L、10－3mol/L 和 10－4mol/L 组，用来调零的为空白对照组。分别继续培养24 h，48 h和72 h。吸去上清液，每孔加入 MTT 20μl，孵育 4 h，加 120μl DMSO 后震荡，各孔490 nm波长处吸光度值（A值）通过酶标仪检测。

1.2.3 免疫组化检测虎杖苷对PCNA表达的影响

6 孔板细胞玻片制作好后用 10－2mol/L、10－3mol/L 和10－4mol/L的虎杖苷作用48 h，对照组不加药。PCNA的表达采用免疫组织化学SABC法染色检测。随机计数100个细胞（放大倍率×200），对阳性细胞及阴性细胞总数进行计算。细胞生长抑制率取平均值。实验组细胞抑制率（%）=（阴性对照组A值－实验组A值）/阴性对照组A值×100%（A值均取平均值）。

1.2.4 流式细胞仪检测各细胞周期 将细胞消化、同步化、分组培养同前。先用0.25%胰酶消化和收集细胞，再用体积比为70%乙醇溶液重悬并固定细胞。

2 结果

2.1 翼状胬肉成纤维细胞免疫组织化学鉴定 组织块接种培养4～5 d后，细胞呈星芒状生长，且大部分细胞以梭形为主，同时夹有圆形或多角形细胞；2 W后，呈灶状或片状，细胞与细胞间连接成网状。传代至3代后，基本为梭形，生长加快。HE染色后见细胞呈现梭形，均胞质，淡红色，胞质有突起，核蓝染，椭圆形，染色质均匀，核仁不明显（图1）。细胞培养后经鉴定波形蛋白染色阳性，存在于胞浆，与细胞长轴方向平行，呈棕黄色束状或网状结构（图2）；空白对照未见棕色颗粒（图 3）。

图1 人翼状胬肉组织的培养细胞HE染色呈阳性（×100）

图2 波形蛋白阳性染色呈均匀一致的棕色颗粒，细胞呈梭形（×100）

图3 阴性对照无棕色颗粒出现（×100）

2.2 虎杖苷对HPF增殖的影响 不同药物浓度组对细胞形态作用不同，高浓度组（10－2mol/L）细胞数量减少，呈不规则形且折光性降低，胞质中可见颗粒样物质；10－3mol/L 浓度组变化不明显；10－4mol/L浓度组细胞生长旺盛。成纤维细胞给予不同浓度虎杖苷干预24 h，48 h和72 h后，采用t检验分别比较各作用时间点及浓度组与对照组细胞A值的差值，不同时间点各浓度组与对照组细胞A值的差异均有统计学意义（P＜0.05），详见表 1。

表1 虎杖苷不同时点对成纤维细胞增殖的影响（±s）

表1 虎杖苷不同时点对成纤维细胞增殖的影响（±s）

组别 24 h 48 h 72 h A值 抑制率（%） A值 抑制率（%） A值 抑制率（%）对照组 0.514±0.021 0 0.618±0.176 0 0.671±0.198 0 10－2 mol/L 组 0.145±0.047 71.79 0.157±0.046 74.60 0.166±0.051 75.26 10－3 mol/L 组 0.441±0.098 14.2 0.596±0.183 3.56 0.667±0.217 0.6 10－4 mol/L 组 0.579±0.121 －12.65 0.697±0.213 －12.78 0.774±0.245 －15.35

2.3 免疫组化检测虎杖苷对HPF表达PCNA的影响 细胞核中出现棕黄色、黄色或浅黄色均匀细小颗粒为阳性；细胞核无变化，胞质呈淡黄色为阴性。10－2mol/L 虎杖苷抑制 HPF 表达 PCNA，10－4mol/L虎杖苷促进 HPF表达 PCNA（P＜0.05），详见表 2。

表2 不同浓度虎杖苷对HPF表达PCNA的影响

2.4 流式细胞仪检测各细胞周期情况 虎杖苷对细胞周期的影响，10－2mol/L组细胞停滞于G1期；10－3mol/L组G1期细胞数减少，S期细胞数增加；与对照组比较差异有显著性意义（P＜0.05），见表3。

表3 不同浓度虎杖苷对成纤维细胞细胞周期的影响（x±s）

3 讨论

翼状胬肉是一种向角膜表面生长与结膜相连的纤维血管样组织，以鼻侧睑裂区多见。翼状胬肉含有大量新生的血管纤维组织，具有较强的侵袭性，向角膜缘生长，角膜前弹力层被玻璃样或弹性组织所代替，角膜正常结构被破坏；向角膜内呈进行性侵入生长，具有肿瘤样特性，故认为是一种肿瘤样病变［3］。外界各种刺激作用使结膜下胶原纤维发生变性，同时角膜前弹力层受损致角膜上皮变性，结缔组织长入已变性的角膜组织中形成胬肉。本病发病与环境密切相关，如阳光、沙尘等各种慢性刺激，日光中的紫外线是引起翼状胬肉的重要原因。近期已通过细胞分子生物技术，证明了其发生机制涉及基因成分、抗凋亡机制、细胞因子、生长因子、细胞外基质重塑、免疫和病毒感染等［4］。病理学研究表明成纤维细胞在翼状胬肉的形成过程中起重要作用，因此，寻找抑制成纤维细胞增殖的药物非常重要。以往研究表明，在翼状胬肉发生过程中，细胞凋亡失控而不及增殖，导致结膜纤维组织及新生血管过度增殖。增殖与凋亡的细胞调节基因参与了翼状胬肉组织的异常增殖。促进凋亡基因表达较抑制凋亡基因表达增强细导致胞凋亡。兰榕等［5］检出初发及复发性翼状胬肉中Bcl－2的表达，翼状胬肉中Bcl－2的表达较正常球结膜显著增高，复发性翼状胬肉中Bcl－2表达高于初发性翼状胬肉，可见Bcl－2在翼状胬肉增殖及复发中非常重要。

以往抗纤维化、抗增殖作用的药物主要为抗肿瘤药物如5－氟尿嘧啶、丝裂霉素等，这些药物在抗增殖的同时对正常组织不良反应大，因此临床应用受限制。近期有研究表明虎杖苷有抗纤维增生的作用，据报道，10－2mol/L虎杖苷对成纤维细胞有促凋亡作用［6］，对正常细胞的毒性较小。 虎杖苷（polydatin，PD）又名白藜芦醇苷，近年研究［7，8］发现，虎杖苷可有效地抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡，对正常细胞毒性较小。虎杖苷可减少心肌缺血/再灌注后线粒体结构的破坏，抑制心肌细胞凋亡，降低凋亡率；增加心肌 B 细胞淋巴瘤－2（B cell lymphoma－2，Bcl－2）蛋白的表达及 Bcl－2/Bax 的比值［9］。

该研究采用了体外细胞培养的方法观察了不同浓度组虎杖苷对成纤维细胞增殖的作用，10－2mol/L浓度组 HPF表达 PCNA细胞数减少，10－2mol/L浓度组有促进细胞凋亡的作用，10－3mol/L浓度组作用不明显，相反10－4mol/L浓度组可促进细胞生长，在虎杖苷作用24 h后即可观察到细胞变化，因此，不同的用途对于浓度的选择非常重要。另外，10－2mol/L为最合适的浓度，其抗增殖机制有待进一步研究。