乳没活络散的鉴别和限量检查研究*

陈思颖 ，田 勇 ，李莉娜 ，3，陆 苑 ，王永林 ，李勇军 ，王爱民 △

（1.贵州医科大学·贵州省药物制剂重点实验室 药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550004；2.思南田氏民族传统骨伤医院，贵州 铜仁 565100； 3.贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550004；4.贵州医科大学·民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004）

乳没活络散是贵州省思南田氏民族传统骨伤医院根据具有200多年民间药用历史的家传秘方研制开发的医疗机构制剂（黔药制字Z20170134），具有活血化瘀、舒经活络、消肿止痛的功效，可用于治疗闭合性骨折、跌打扭伤及骨伤病变等疾病。该方针对骨折、跌打扭伤“气滞血瘀证”遣方用药，由三七、乳香、没药、制川乌、制草乌等10味中药组方，经过30余年的临床使用，疗效显著，深受患者欢迎。本研究中参考相关标准和文献制订了乳没活络散的显微鉴别方法，对乳香、苏木、续断进行薄层色谱（TLC）鉴别，对制川乌、制草乌中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱限量进行检查，以控制乳没活络散的质量，提高临床用药的有效性和安全性。现报道如下。

图1 乳没活络散显微鉴别图

1 仪器与试药

1.1 仪器

尼康50i显微镜和尼康DS－Fi2成像系统（放大倍率为10～1 500倍，日本尼康公司）；TLCACANNER 3型薄层色谱成像系统（瑞士卡玛公司，参数：230V，50／60Hz，80 VA，UV 254／366 nm 紫外光管，400～750 nm 白光管）；CQ－250A－ST型超声波清洗机（四川中浪科技有限公司）。

1.2 试药

乳香对照药材（批号为120970－201305，规格为0.5 g），没药（天然没药）对照药材（批号为 120967－201405，规格为1 g），苏木对照药材（批号为121067－201606，规格为1 g），续断对照药材（批号为 121－33－201311，规格为2 g），均购自中国食品药品检定研究院；乌头碱对照品（批号为150325，规格为20 mg），次乌头碱对照品（批号为150811，规格为20 mg，），新乌头碱对照品（批号为150913，规格为20 mg），均购自四川省维克奇生物科技有限公司，上述对照品经高效液相色谱（HPLC）法测定含量均不低于98%；三氯甲烷（国药集团化学试剂有限公司，批号为20160803，规格为每瓶0.5 L）等试剂均为分析纯；硅胶G和硅胶GF254薄层板（青岛海洋化工厂，规格为100 mm×100 mm）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别[1－5]

参照2015年版《中国药典（四部）》通则2001“显微鉴别法”，取乳没活络散，按粉末制片法制片后置显微镜下观察，结果见图1。淀粉粒众多，网纹、梯纹导管，草酸钙簇晶，木栓细胞长方形或多角形（三七）；不规则团块，无色或淡黄色，表面及周围扩散出众多细小颗粒（乳香）；不规则碎块，淡黄色半透明渗出油滴（没药）；石细胞呈长方形或类长方形，直径40～120μm（制川乌和制草乌）；体壁碎片上有短粗或细长刚毛（土鳖虫）。

2.2 薄层色谱鉴别

乳香[1，6－10]：取乳没活络散 3 g，加无水乙醇 15 mL，超声处理15 min，滤过，水浴浓缩至2 mL，作为供试品溶液；另取缺乳香的阴性制剂，同法制备阴性对照品溶液；再取乳香对照药材适量，同法处理，制得对照药材溶液。分别吸取上述3种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）－甲苯－乙酸乙酯（10 ∶1.5 ∶1.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 1%的香草醛硫酸溶液（以60%硫酸水溶液作为溶剂），在105℃加热至斑点显色清晰。结果斑点清晰，比移（Rf）值适中。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。详见图2 A。

苏木[1，9－10]：取乳没活络散 1 g，置索式提取器中，加乙醚适量加热回流除去脂溶性成分，药渣挥干乙醚，再加甲醇适量，加热回流提取1 h，甲醇提取液挥干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；另取缺苏木的阴性制剂，同法制备阴性对照品溶液；再取苏木对照药材0.5 g，同法处理，制得对照药材溶液。分别吸取上述供试品溶液和阴性对照品溶液各10μL，对照药材溶液5μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷－丙酮 －甲酸（8∶4 ∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，分别置日光和紫外光灯（254 nm）下视检，室温放置12 h后日光下再次检视。结果室温放置12 h后色谱斑点显色清晰，供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。详见图2 B。

续断[1，11－13]：取乳没活络散 0.5 g，加甲醇适量，超声处理25 min，滤过，滤液蒸至近干，残渣加水20 mL使溶解，滤过，滤液加浓氨水5 mL，再加水饱和的正丁醇提取3次，每次15 mL，合并上层溶液，加正丁醇饱和的水洗涤3次，每次15 mL，合并上层溶液，蒸至近干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取缺苏木的阴性制剂0.5 g，同法制备阴性对照品溶液，再取续断对照药材0.1 g，同法制成对照药材溶液。分别吸取对照药材溶液2μL，供试品溶液和阴性对照品溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇－醋酸－水（4∶1∶5）10℃以下放置的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃ 加热至斑点显色清晰。结果供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。详见图2 C。

图2 薄层色谱图

2.3 双酯型生物碱限量检查[1，13－14]

生川乌和生草乌中含有以乌头碱、新乌头碱和次乌头碱为主的毒性成分双酯型生物碱，经炮制后水解为毒性较低的单酯型生物碱。为控制乳没活络散质量，本研究中对制剂中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的限量检查进行了研究。

取乳没活络散10 g，加氨试液20 mL拌匀，放置1 h，加三氯甲烷100 mL，加浓氨水4 mL，超声处理30 min，滤过，残渣和滤器用适量三氯甲烷洗涤，洗涤液与滤液合并，分取三氯甲烷层，置分液漏斗中，用5% 盐酸溶液提取3次，每次20 mL，合并上层溶液，用浓氨水调节pH至11～12，用三氯甲烷提取3次，每次20 mL，合并下层溶液，回收至干，残渣加甲醇溶解成1 mL，作为供试品溶液；取缺制川乌、制草乌的阴性制剂，同法制备阴性对照品溶液；取缺制川乌、制草乌的阴性制剂，分别加入乌头碱、新乌头碱和次乌头碱对照品适量，同法制备阴性对照品溶液加混合对照品溶液。再取乌头碱、新乌头碱和次乌头碱对照品适量，用0.1%甲酸甲醇溶液溶解，制成 0.48，0.24，0.12 g／L 3种质量浓度的混合对照品溶液。分别吸取供试品溶液10μL和3种质量浓度的混合对照品溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷 －乙酸乙酯 －甲醇（3.2∶1.8∶1）为展开剂，置氨蒸气饱和30 min的展开缸内展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，在日光下检视。结果阴性对照无干扰，质量浓度为0.48，0.24 g／L的乌头碱、新乌头碱和次乌头碱显色清晰，质量浓度为0.12 g／L的乌头碱、新乌头碱和次乌头碱显色不明显，表明本方法检测乌头碱、新乌头碱和次乌头碱检出限为1.2μg（0.24 g／L对照品溶液点样5μL），详见图3。

图3 双酯型生物碱限量确定薄层色谱图

吸取上述质量浓度为0.24 g／L对照品溶液5μL，供试品溶液和阴性对照品溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，同法展开显色。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上出现的斑点应小于对照品溶液的斑点或不出现斑点，且阴性对照无干扰。详见图4。

图4 双酯型生物碱限量检查薄层色谱图

3 讨论

乳香鉴别试验中，分别以石油醚（60～90℃）－甲苯－乙酸乙酯（10∶1.5∶1.5）、石油醚－甲苯 －乙酸乙酯（10∶1.5∶1）及石油醚（60～90℃）－甲苯 －乙酸乙酯（10∶1.5∶0.5）为展开剂，结果以石油醚（60～90℃）－甲苯－乙酸乙酯（10∶1.5∶1）为展开剂时展开效果较好，斑点清晰，Rf值适中，故试验中选用以其为展开剂。

双酯型生物碱的限量检查中，发现乌头碱、新乌头碱和次乌头碱在甲醇中稳定性较差，混合对照品溶液在含0.1%甲酸的甲醇溶液中稳定性较好。

乳没活络散中制川乌和制草乌占全方的6%，2015年版《中国药典（一部）》制川乌和制草乌项下规定，双酯型生物碱以乌头碱、次乌头碱及新乌头碱的总量计，均不得超过0.04%。因此，10 g制剂中双酯型生物碱以乌头碱、新乌头碱和次乌头碱总量不得超过0.24 mg（10 g×6% ×0.04% ＝0.24 mg，经供试品溶液制备后，3种生物碱均为0.24 g／L）。为保证制剂的安全性，供试品中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱在薄层色谱上的斑点不得比0.24 g／L对照品溶液点样5μL的斑点深（即10 g乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的限量不高于 0.24 mg）。