复方二氯乙酸二异丙胺对食管癌的抗肿瘤活性及药理学机制研究

宋竹梅，宋红梅，桂金川，吴海波

（四川省达州市中心医院，四川 达州 635000）

食管癌是排名全球前10的恶性肿瘤，我国食管癌每年新发及死亡人数约占全球的50%，是继胃癌、直肠癌后极易发病的恶性肿瘤[1]。食管癌发病诱因多，如年龄、职业、饮食习惯及家族遗传史等，其中吸烟和饮酒是重要的危险因素，且我国发病患者以鳞癌为主。虽然放射治疗（简称放疗）技术更加精确，不良反应也已相应降低，但大多数患者在治疗时已处于中晚期，接受手术及放疗、化学治疗（简称化疗）后效果不佳，预后很差，5年生存率不到20%[2]。有研究表明，机体糖酵解与食管癌的发生、发展密切相关，并与食管癌放疗抵抗作用关系紧密[3]。另有研究表明，二氯乙酸二异丙胺（diisopropylamine dichloroacetate，DADA）在生理学角度可调节细胞代谢，逆转糖酵解作用[4]。本研究中探讨了DADA对食管癌的抗肿瘤活性及其药理学机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

细胞培养皿：6，24，96孔细胞培养板及离心管（美国Corning公司）；低温冰箱（日本三洋公司）；电子天平（上海精天电子仪器公司）；低温离心机（德国西门子公司）；垂直电泳仪（美国Bio－Rad公司）；Western电转仪（日本岛津公司）等。

食管鳞癌细胞株Eca－109，TE－13（细胞株编号为TCHu 69，中国科学院）；二氯乙酸（dichloroacetic acid，DCA，行知生物科技有限公司）；二氯乙酸二异丙胺（武汉禾元生物科技有限公司）。细胞培养基及Annexin VFITC／PI细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技有限公司）；CCK－8 溶液（南京凯基科技有限公司）；Matrigel（美国Millipore公司）；Transwell小室（美国Corning公司）。

1.2 方法[5]

抗肿瘤活性分析：96孔板中每孔加入100μL转染24 h后的对数期细胞，在5%CO2及37℃条件下单层铺满孔底，每孔加入10μL CCK－8溶液，其中将加入细胞培养液及CCK－8溶液未加细胞的孔作为空白对照，在450 nm波长检测24 h时的吸光度。使用8μm膜小室及BDSioCoatTMMatrgelTMInvasion Chamber检测DADA对食管癌细胞株的侵袭转移作用。使用染色流式细胞技术及蛋白质印迹法（Western blot）检测Caspase－3的活性形式来分析DADA对食管癌细胞株的凋亡作用。

药理学机制分析：采用克隆形成试验及多靶单击模型探讨DADA对食管癌细胞株放疗的敏感性影响；制作大鼠皮下荷瘤模型，进一步验证体内DADA联合放疗对放疗敏感性的影响；运用Western blot、流式细胞仪检测DADA联合放疗后食管癌细胞株内γ－H2AX的表达、细胞周期及细胞凋亡情况；运用活性氧（reactive oxygen species，ROS）试剂盒检测DADA联合放疗后食管鳞癌细胞内ROS水平。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 DADA食管癌抗肿瘤活性分析

CCK－8细胞毒性试验：结果显示，24 h时，DADA作用于 Eca－109和 TE－13细胞株的半抑制浓度（IC50）分别为 18 mmol／L 和 22 mmol／L，DCA 作用于Eca－109和TE－13细胞株的 IC50分别为32 mmol／L和 33 mmol／L，表明 DADA 对 Eca－109和 TE－13细胞株的抗肿瘤活性强于DCA。

食管癌细胞株侵袭转移作用：将 IC50时的DADA剂量作用于Eca－109和TE－13细胞株，检测24 h后的细胞功能。与对照组相比，不管Matrigel还是Transwell小室试验，DADA处理后的Eca－109和TE－13细胞株通过小室膜的细胞数大量减少（t1＝5.329、P1＝0.034，t2＝5.352、P2＝0.031），表明经过 DADA 处理过的食管癌细胞株迁移能力显著减弱。细胞迁移图像见图1。

食管癌细胞株凋亡试验：试验结果显示，经DADA处理过的食管鳞癌 Eca－109和 TE－13细胞株内Cleaved Caspase－3 蛋白含量显著增加（χ21＝6.823、P1＝0.024，χ22＝6.897、P2＝0.021），表明经 DADA 处理过的食管鳞癌细胞株的凋亡细胞数明显增加。详见表1。

2.2 DADA药理学机制分析

对食管癌细胞株放疗敏感性的影响：研究结果显示，对于食管鳞癌Eca－109和TE－13细胞株，DADA联合放疗较单纯放疗敏感度分别增加1.38倍和1.05倍。详见表2。Western blot检测γ－H2AX蛋白结果显示，对于Eca－109和TE－13细胞株，DADA联合放疗与单用DADA、单用放疗相比，γ－H2AX蛋白水平均显著升高（χ21＝4.163、P1＝0.036，χ22＝4.731、P2＝0.034，χ23＝4.526、P3＝0.035，χ24＝4.953、P4＝0.031）。流式细胞仪检测结果显示，DADA联合放疗与单用DADA、单用放疗相比，G2／M周期的细胞数量显著升高（t1＝3.711、P1＝0.041，t2＝3.825、P2＝0.043）。表明 DADA 联合放疗可以增加DNA双链的断裂，使大量细胞阻滞在G2／M周期，从侧面表明DADA可以通过多渠道增加放疗敏感性。详见表2。

图1 食管癌细胞株迁移图像

表1 DADA处理前后食管鳞癌Cleaved Caspase－3蛋白表达

表2 DADA对食管癌细胞株放疗敏感性的影响

对食管癌细胞株放疗敏感性体内验证及ROS水平检测结果：结果显示，3组大鼠中，DADA联合放疗治疗大鼠肿瘤体积及质量均显著低于单用DADA及单用放疗大鼠（P＜0.05），进一步说明DADA联合放疗可以增加放疗敏感性，抑制肿瘤生长。DADA联合放疗大鼠的Eca－109和TE－13细胞株内的ROS水平显著增加（P ＜0.05）。详见表 3。

表3 3组大鼠治疗后肿瘤质量及体积比较（±s）

表3 3组大鼠治疗后肿瘤质量及体积比较（±s）

组别DADA联合放疗组DADA组放疗组F值P肿瘤质量（g）10.31±2.18 15.69±1.96 16.71±2.04 1.803＜0.05肿瘤体积（cm3）2.62±0.42 4.19±0.94 5.27±1.27 13.073＜0.05 ROS（U ／mL）1443.45±59.39 1106.27±36.17 1242.98±42.62 5.247＜0.05

3 讨论

食管癌预后不理想，5年生存率极低[6－7]，临床治疗方法主要有手术、化疗、靶向治疗及放疗等，放疗在治疗癌症方面起着重要作用，但不同癌种类、不同个体等对放疗的敏感性不同[8－12]。有研究表明，癌细胞的能量代谢与放疗的敏感性密切相关。二氯乙酸盐可降低细胞糖酵解，作为抗肿瘤药物已广泛应用于临床；DADA含有二氯乙酸盐的活性成分，可影响机体内糖酵解调控细胞能量代谢[13－15]。

本研究结果显示，DADA对Eca－109和TE－13细胞株的抗肿瘤活性高于DCA，经DADA处理后的Eca－109和TE－13细胞株，通过小室膜的细胞数目大量减少，表明经DADA处理过的食管癌细胞株迁移能力显著下降。但细胞株内的Cleaved Caspase－3蛋白含量显著增加，表明经过DADA处理过的食管癌细胞株细胞凋亡数量显著上升，因为Cleaved Caspase－3是蛋白酶家族中具有促进细胞凋亡作用的Caspase－3的活性形式。

糖酵解与放疗敏感性紧密相关，癌细胞糖酵解产生大量三磷酸腺苷（ATP）的同时可释放很多大分子物质，如乳酸、丙酮酸等，而这些大分子可有效清除细胞中的氧化自由基（如ROS等），从而降低癌细胞对放疗的敏感性[16－17]。本研究结果显示，对于食管鳞癌Eca－109和TE－13细胞株，DADA联合放疗的放疗敏感度增加1倍，而且Eca－109和TE－13细胞株中ROS水平显著增加，说明DADA通过增加癌细胞株中氧化磷酸化水平而增加ROS水平，从而提高其放射治疗敏感性，与上述研究推论一致。DADA联合放疗与单用DADA、单用放疗相比，Eca－109和TE－13细胞株中γ－H2AX蛋白水平显著升高，G2／M周期的细胞数量显著升高，其中γ－H2AX蛋白是细胞DNA双链损伤程度的标志物，γ－H2AX蛋白水平越高，DNA双链损伤越严重，而放射治疗的原理之一也是产生大量ROS，ROS进一步引起DNA双链断裂[18]。因此γ－H2AX蛋白水平的升高可从侧面反映出DADA可增加食管鳞癌放射治疗的敏感性。本研究结果显示，DADA联合放疗治疗大鼠，其肿瘤体积及质量均显著低于单用DADA及单用放疗（P＜0.05）。

综上所述，DADA可抑制食管癌肿瘤细胞生长，促进凋亡，且抑制其迁移，与放疗联用可通过增加癌细胞中ROS水平而增加食管癌放疗的敏感性，从而更好地发挥其抗肿瘤活性。