格列美脲下调miRNA－214表达抑制人乳腺癌细胞MCF－7增殖作用的研究*

方志华 ，梁君伟 ，吕喜英 △

（1.河北省承德市第三医院，河北 承德 067000； 2.承德医学院附属医院，河北 承德 067000）

目前，乳腺癌占恶性肿瘤的7%～10%，已成为威胁人类健康的恶性疾病，且发病率还在不断攀升[1－2]。有研究显示，糖尿病能增加患乳腺癌的风险，且与其预后相关[3－4]。临床研究发现，糖尿病经常与癌症同时存在，如合并乳腺癌[5]。在治疗乳腺癌的同时控制好血糖可获得较好的预后。流行病学研究表明，临床常用的一线降糖药物二甲双胍可降低乳腺癌发病率，并对改善乳腺癌患者的预后有一定作用[6－7]。Bruderer等[8]研究发现，长期使用二甲双胍治疗糖尿病的女性患者患乳腺癌的风险会降低。体外研究发现，二甲双胍可减少荷瘤裸鼠肿瘤的体积和抑制人乳腺癌细胞MCF－7增殖[9]。格列美脲为临床常用的第3代磺酰脲类抗糖尿病药物，常用于治疗2型糖尿病，但其是否也像二甲双胍一样具有治疗乳腺癌的作用，目前研究较少。降糖药物治疗癌症的机制目前并不清楚，研究发现，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类调控蛋白质编码基因的内源性非编码RNAs，在真核生物中存在，参与细胞分化、细胞增殖和凋亡等各种过程，与肿瘤密切相关，参与肿瘤发生、发展过程[10]。miRNA－214是新近发现的一种miRNA，也具有调节细胞生长、分化和凋亡的作用，在乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌等癌组织中表达上调[11]。因此，本研究中通过研究格列美脲对人乳腺癌细胞MCF－7增殖的影响，检测miRNA－214的表达情况，从miRNA水平探讨格列美脲治疗乳腺癌可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株、试药与仪器

细胞株与试药：人乳腺癌细胞MCF－7（西安赛拓博泰生物公司，编号CM－1250）。格列美脲分散片（石药集团欧意药业有限公司，国药准字H20100182，规格为每片2 mg），用无血清RPMI－1640培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司，规格为每瓶 500 mL，货号11965－092）配制成质量浓度为1 g／L的贮备液，过滤除菌，分装，－20℃保存备用，使用培养基稀释到所需质量浓度。

试剂：胎牛血清（江苏汇达医疗器械有限公司，规格为 每 瓶 100 mL，货 号 10099－141）；PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）RNA 反转录试剂盒（上海碧云天公司，货号 DRR037A，可用200次）；SYBR Premix Ex Taq TMⅡ荧光定量PCR试剂盒（上海碧云天公司，货号 HZ－F360，可用 100 次）；ANNEXIN VFITC／PI凋亡检测试剂盒（上海碧云天公司，货号CA1020，可用 50 次）；miRNA －214，Bax，Bcl－2，Caspase－3引物（大连 TaKaRa＜中国＞公司）；Trizol Reagent RNA提取试剂盒（美国Invitrogen公司，规格为100 mL，货号 15596 －026）；MTT（美国 Amresco公司，货号M5655，可用50次）。

仪器：BIO－RAD型垂直电泳仪（美国BD公司）；倒置显微镜（特瑞欧奥林巴斯公司）；高速低温离心机（上海浦东天本离心机公司）；二氧化碳细胞培养箱（苏达实验仪器有限公司）；电泳仪、电转移槽及电源、凝胶成像分析系统（北京六一仪器厂）；流式细胞仪（美国BD FACSCalibur公司）；逆转录仪（杭州博日科技有限公司）；Real Time PCR仪（美国BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及实验分组

用含10%小牛血清的 RPMI－1640培养液，在37℃，5%CO2，饱和湿度的环境中培养人乳腺癌细胞MCF－7。当MCF－7细胞处于对数生长期时进行试验，分为空白对照组及格列美脲低、中、高剂量组。空白对照组在接种后待细胞生长到融合状态，正常培养48 h，格列美脲低、中、高剂量组接种后待细胞生长到融合状态，分别给予终质量浓度为10，20，40μg／mL的格列美脲，继续培养48 h后收获细胞，进行相关检测。

1.2.2 MTT法检测细胞存活率

选择对数生长期MCF－7细胞，消化后调整细胞浓度，以 5×103／孔接种于 96孔板，200μL／孔，待细胞融合后，弃培养基，依次加入终质量浓度分别为0，5，10，20，40，60，80μg／mL 的格列美脲 RPMI－1640培养基，200 μL ／孔，培养 48 h，加入 MTT，50 μL ／孔。培养 4 h，弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO），200 μL ／孔，振荡10 min，用检测的吸光度（OD）值，计算MCF－7细胞的存活率。每个剂量组设6个平行样。

1.2.3 实时荧光聚合酶链反应（RT－PCR）法检测miRNA －214，Bax，Bcl－2和 Caspase－3 mRNA 表达

按照细胞培养项下方法处理细胞，消化后根据RNA提取试剂盒操作说明书进行总RNA提取，并根据反转录试剂盒说明合成cDNA，根据SYBR Premix Ex Taq TMⅡ荧光定量PCR试剂盒说明，制备20μL反应体系，在CFX－96 PCR扩增仪中进行扩增。反应条件为预变性 95 ℃ 30 s，变性 95 ℃ 5 s，60 ℃ 44 s，40 个循环，采集数据分析结果。

1.2.4 细胞凋亡检测

按照细胞培养项下方法处理细胞，消化后测定MCF－7细胞凋亡率。每孔5×105个细胞，每个剂量组设5个平行样。

1.3 统计学处理

2 结果

结果见表1至表4、图1和图2。

表1 格列美脲对MCF－7细胞增殖的影响（±s）

表1 格列美脲对MCF－7细胞增殖的影响（±s）

注：与 0μg／mL比较，F ＝8.52，a P ＜0.05。

质量浓度（μg／mL）0 5 10 20 40 60 80作用时间（h）48 48 48 48 48 48 48细胞增殖率（%）96.42±9.73 89.45±4.50 72.34±6.47a 54.22±5.41a 46.28±12.84a 36.54±6.28a 21.27±11.67a

3 讨论

miRNA是一种非编码单链小分子RNA，能以碱基互补的形式结合到靶基因的非编码区，转录后 基因进行负调控。其存在于人体外周血，且在血液中稳定而持续地表达，结果具有可重复性，参与了多种细胞的进程（细胞增殖、分化、凋亡等）[12]。在人类肿瘤发生的变异区域内约50%检测到miRNA基因，提示miRNA可能

与肿瘤发生、发展密切相关[13]。近年来研究发现，由 miRNA表达谱异常引起的基因转录后调控与许多肿瘤发生、发展、侵袭和转移密切相关，如乳腺癌、胃癌、小细胞肺癌和肝癌等[14]。在癌组织中，一些miRNA会特异表达增高或降低，如miRNA－155，miRNA－10b，miRNA－21等常过度表达，而miRNA－214，miRNA－518b，miRNA－17p，miRNA－126，miRNA－335，miRNA －205等则表达下调，从而促进肿瘤细胞的发生、发展、侵袭和转移[15]。miRNA在细胞或组织中具有特异性，故miRNA在疾病的诊断和治疗中有广阔前景。

表2 格列美脲对人乳腺癌细胞MCF－7 miRNA－214和Caspase－3 mRNA表达的影响（±s）

表2 格列美脲对人乳腺癌细胞MCF－7 miRNA－214和Caspase－3 mRNA表达的影响（±s）

注：与空白对照组比较，F＝12.20，20.41，a P＜0.05，b P＜0.05。

组别空白对照组低剂量组中剂量组高剂量组作用时间（h）48 48 48 48总RNA（ng／μL）31.24±2.48 35.12±5.71 32.70±4.75 30.78±5.74 miRNA－214 1.00±0.08 0.91±0.17 0.64±0.16a 0.49±0.13a Caspase－3 1.00±0.10 1.15±0.21 1.61±0.24b 1.89±0.15b

表3 格列美脲对人乳腺癌细胞MCF－7 Bax和Bcl－2 mRNA表达的影响（±s）

表3 格列美脲对人乳腺癌细胞MCF－7 Bax和Bcl－2 mRNA表达的影响（±s）

注：与空白对照组比较，a P＜0.05。

组别空白对照组低剂量组中剂量组高剂量组作用时间（h）48 48 48 48 Bax 1.00±0.09 1.43±0.11a 1.82±0.17a 2.05±0.14a Bcl－2 1.00±0.12 1.08±0.10 1.27±0.03a 1.29±0.27a Bax ／Bcl－ 2 1.03±0.14 1.36±0.22 1.47±0.09a 1.60±0.14a

表4 格列美脲对人乳腺癌细胞MCF－7细胞凋亡的影响

图1 人乳腺癌细胞MCF－7 mRNA电泳图

图2 格列美脲诱导MCF－7细胞凋亡图

miRNA－214在多种肿瘤疾病中表达异常，通过调控不同靶基因，调节细胞增殖和凋亡[16]。miRNA－214在乳腺癌、肝癌、宫颈癌、骨髓瘤等疾病中表达降低[17]。研究发现，在胰腺癌细胞凋亡受到抑制时，miRNA－214的表达增加，可通过抑制抑癌基因PTEN的表达而抑制肿瘤细胞的凋亡[18]。细胞凋亡为程序性细胞死亡，在机体间维持动态平衡。当机体间这种平衡被打破，就会引发多种疾病，细胞增殖失控与细胞凋亡失常，从而导致肿瘤。同时，诱导肿瘤细胞凋亡也为肿瘤的治疗提供了一个新的方向[19]。B 淋巴细胞瘤－2（B－cell lymphoma－2，Bcl－2）家族参与了细胞凋亡的调控，主要分为促进细胞凋亡（Bax，Bad）、抑制细胞凋亡（Bcl－2、Bclxl）和 BH3－only 蛋白（Bim，Bid，DP5）3 个家族[20]。Bcl－2家族相关蛋白主要分布于细胞器膜上。当受到促进凋亡的药物作用时，Bcl－2表达则受到抑制，Bax表达升高，使线粒体膜电位发生改变，使膜通道开放，细胞色素C释放到细胞质中，诱导凋亡小体形成，从而激活Caspase家族，最终导致细胞凋亡。Bax／Bcl－2是一个较灵敏的指标，其增高决定了细胞进入凋亡的执行期。Caspase家族是细胞凋亡执行者，被激活后将引发Caspase级联反应，凋亡启动因子（Caspase－2，Caspase－9等）发生活化，并激活下游凋亡执行因子（Caspase－3，Caspase－6，Caspase－7 等），尤其是 Caspase－3的激活，表示细胞凋亡进入不可逆阶段，最终导致细胞进入凋亡阶段[21]。

本研究结果发现，格列美脲能抑制人乳腺癌细胞MCF－7细胞增殖，通过下调MCF－7细胞中miRNA－214 mRNA的表达，启动细胞凋亡程序，使Caspase－3，Bax，Bcl－2 mRNA 表达增加，Bax／Bcl－2 增高，从而促进MCF－7细胞凋亡，为格列美脲抑制乳腺癌细胞生长提供一定的理论依据。